论文部分内容阅读
目的：缺血性脑血管病已经成为严重影响我国中老年人健康的常见疾病,并有逐年递增的趋势,目前临床的治疗措施主要是溶栓和介入。这些治疗一方面可使缺血的脑组织及时得到再通,恢复脑组织功能,但另一方面部分患者脑功能不仅没能恢复,反而出现病情进一步加重,此即缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)损伤。I/R损伤的发病机制极其复杂,对其防治具有很大困难,因此,找到参与I/R损伤的关键靶点并用于缺血性脑血管病的治疗,成为当前研究的热点之一。程序性细胞死亡因子4 (Programmed Cell Death 4, PDCD4)作为一种抑癌基因,研究显示它可直接与靶基因的mRNA编码区域结合阻断翻译过程,或通过与真核细胞翻译起始因子(Eukaryotic Translation Initiation Factor, elF) 4G竞争性结合eIF4A,抑制靶蛋白的翻译起始,进而影响细胞的增殖、凋亡、转化、侵袭及自噬等生物学行为；同时研究发现PDCD4可以促进炎症的发生,在肿瘤、肥胖、糖尿病和心血管等疾病的发生发展中发挥重要作用,但是PDCD4在缺血性脑血管病中的作用尚不明确。本实验拟通过大脑中动脉栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)和细胞的糖氧剥夺模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)从体内和体外两方面来深入研究PDCD4在缺血再灌注损伤中的作用及机制,找到参与I/R损伤的关键靶点,用于缺血性脑血管病的治疗。方法：1.脑缺血再灌注损伤后PDCD4在小鼠脑中的作用及表达变化1.1将野生型(Wild Tipe, WT)小鼠和PDCD4-/-敲基因小鼠随机分组,建立大脑中动脉栓塞模型。在缺血2h后不同的再灌注时间点取材,利用神经病学评分、TTC染色、HE染色、尼氏染色、TUNEL等方法验证PDCD4在脑缺血再灌注损伤中的生物学作用。1.2通过Western blot、免疫组织荧光双标检测PDCD4在损伤后的分布及表达变化。2.探究PDCD4在脑缺血再灌注损伤中的作用机制2.1通过TUNEL染色,Western blot检测Bcl-2/Bax及caspase-3观察神经元凋亡的改变,从而验证PDCD4对脑缺血再灌注后凋亡水平的影响。2.2用实时定量RT-PCR法检测缺血再灌注模型后PDCD4-/-小鼠及WT小鼠促炎因子IL-6, IL-1β, TNF-α,趋化因子MCP-1以及抑炎因子IL-10等细胞因子的变化,进而探究PDCD4能否通过炎性反应加重脑损伤。2.3利用透射电镜观察自噬小体形成及超微结构变化,免疫荧光染色及Western blot等观察自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1及Atg5等亚细胞定位及表达变化,以确定PDCD4对脑缺血再灌注损伤后自噬的调节。通过Western blot检测内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)的关键分子BIP和CHOP,探究PDCD4对ERS介导的自噬的调控。3.糖氧剥夺(OGD)后PDCD4的表达变化及对下游通路的调控3.1本实验选用大鼠来源的神经细胞株PC-12,小鼠来源的小胶质细胞株BV-2为研究对象,转染siRNA-PDCD4或pEFGP-PDCD4,分别基因沉默或过表达PDCD4,将转染之后的细胞进行OGD处理,在恢复糖氧之后的不同时间点收集细胞,免疫荧光和Western blot检测PDCD4转染效率,以及下游基因LC3B,p-ERK1/2, BIP, CHOP等的表达变化。3.2为了探究MAPK/ERK信号通路对ERS和自噬的作用,我们使用PC-12构建OGD模型,在复糖复氧的同时添加MEK1/2抑制剂U0126,观察阻断MAPK/ERK信号通路后ERS和自噬的表达变化。在OGD条件下,取BV-2细胞用Real-time RT PCR法检测相关炎性因子的表达变化,进一步验证PDCD4在炎性方面对再灌注损伤的影响。结果：1. PDCD4的缺失对脑缺血再灌注损伤具有保护作用通过神经学评分、TTC染色,我们发现在MCAO模型后,PDCD4-/-敲基因组与WT组相比神经学评分显著降低,脑损伤面积明显减少；同时HE、Nissl和TUNEL染色结果进一步证明,PDCD4缺失明显降低脑缺血再灌注损伤。2.脑缺血再灌注损伤后PDCD4的表达先降低后升高2.1我们选取脑损伤后的缺血半暗带(Ischemic Penumbra, IP)作为研究对象,通过Western blot结果分析,我们发现PDCD4在脑损伤后表达有所降低,其中在再灌6小时处达到最低值,24h有所恢复,然后在48小时表达升高。2.2免疫组织荧光双标结果显示,PDCD4分布广泛,在神经元、小胶质细胞和星形细胞中都有表达,但是主要分布于神经元和小胶质细胞中,并且在细胞浆与细胞核中都存在PDCD4的表达。2.3体外实验过程,我们发现神经元细胞系PC-12在做完OGD之后,PDCD4的表达与体内的结果相一致,但是正常小胶质细胞BV-2中PDCD4的含量较低,OGD之后PDCD4表达不断升高。3. PDCD4能够显著提高神经细胞的凋亡水平TUNEL染色结果显示,相对WT小鼠脑缺血模型,PDCD4-/-小鼠中细胞凋亡数显著降低。Western blot分析结果显示,在敲基因小鼠中Bcl-2/Bax及Cleaved Caspase-3的蛋白表达量也显著降低。4. PDCD4通过促进炎性反应加重脑损伤4.1通过对炎症指标的检测,我们发现在缺血再灌12h后,通过Real-timePCR,我们发现促炎因子IL-6, IL-1β, TNF-α和趋化因子MCP-1的表达都升高,但PDCD4-/-小鼠与WT小鼠相比,炎性因子的表达相对降低。4.2在体外实验中,通过基因沉默BV-2细胞中PDCD4,构建OGD模型,通过Real-time PCR检测上述炎性因子,发现相对于正常组,PDCD4沉默后炎性反应降低,与体内结果一致。5. PDCD4能够抑制神经元的自噬水平5.1通过透射电镜对自噬的检测,我们发现相对于WT小鼠,敲除小鼠的自噬小体有所升高；Western blot的结果显示,LC3B的表达也是升高的,但是虽然在PDCD4-/-小鼠中自噬水平相对升高,但是Beclin-1的水平并没有升高,而是Atg5以及Atg12-Atg5的相对表达量有所升高,体外实验也验证了这一点。5.2通过WT小鼠与PDCD4-/-小鼠的Western blot结果分析,我们发现在敲除小鼠中,内质网应激标记蛋白BIP的表达升高,但是CHOP的表达并没有升高,反而有降低的趋势。体外沉默PDCD4之后,得到了相同的结果,而将PDCD4过表达之后,BIP降低,CHOP升高。5.3体内与体外的Western blot结果显示,在PDCD4基因缺失之后,p-ERK的表达升高,同时BIP与LC3B的表达也随之升高,说明p-ERK参与了PDCD4对ERS和自噬的调控。5.4体外通过U0126抑制MAPK/ERK信号通路,我们发现BIP的表达量也受到抑制,而且LC3B的表达与BIP呈现一致性。结论：1. PDCD4能够加重小鼠的脑缺血再灌注后损伤程度。2.在脑缺血再灌注损伤后,不同实质细胞中PDCD4表达变化并不一致,其中神经元中先降低后升高,小胶质细胞中升高。3. PDCD4通过抑制ERK1/2通路抑制ERS及自噬,还可以通过促进凋亡、炎症反应加重脑缺血再灌注损伤。