【摘 要】
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肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）是一种重要的炎性细胞因子,主要是由巨噬细胞和单核细胞产生,是目前已知的唯一能够直接作用于肿瘤细胞的细胞因子,不仅能促进细胞增殖和分化还能杀伤和抑制肿瘤细胞。有关哺乳动物TNF-α在生理或病理条件下的功能以及检测手段都有着广泛而深入的研究,而对于禽类TNF-α的研究则少之又少。直到最近,鸡TNF-α（chTNF-α）的基因才
【基金项目】
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“江苏省特聘教授”人才项目（编号:337060018）；
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肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）是一种重要的炎性细胞因子,主要是由巨噬细胞和单核细胞产生,是目前已知的唯一能够直接作用于肿瘤细胞的细胞因子,不仅能促进细胞增殖和分化还能杀伤和抑制肿瘤细胞。有关哺乳动物TNF-α在生理或病理条件下的功能以及检测手段都有着广泛而深入的研究,而对于禽类TNF-α的研究则少之又少。直到最近,鸡TNF-α（chTNF-α）的基因才被克隆、鉴定,chTNF-α的功能以及检测方法都还有待深入研究。本研究中,将chTNF-α胞外区序列进行密码子优化和基因合成,分别构建原核表达载体pET-45b（+）-His-chTNF-α和真核表达载体pcDNA3.1（+）-His-chTNF-α;纯化原核重组His-chTNF-α蛋白,分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,制备抗chTNF-α的多克隆抗体和单克隆抗体,将pcDNA3.1（+）-His-chTNF-α转染到COS7细胞中通过间接免疫荧光（IFA）筛选能识别真核表达chTNF-α蛋白的杂交瘤细胞;建立检测chTNF-α的抗原捕获ELISA方法,为今后研究chTNF-α在生理或病理条件下的变化提供了免疫学工具。主要研究内容和研究结果如下:1.ch FNF-α载体构建及重组表达根据已发布的chTNF-α基因序列（GenBank#:MF000729）,对其胞外区进行密码子优化并克隆到表达载体pET-45b（+）和pcDNA3.1（+）中。经测序验证后,将重组pET-45b（+）-His-chTNF-α质粒转化到大肠杆菌Rosetta株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot（WB）鉴定发现重组chTNF-α蛋白以可溶形式表达。通过对表达条件优化,确定最佳表达条件为0.1 mM IPTG,18℃诱导12 h。采用Ni-NAT亲和柱纯化,获得26kD的重组蛋白,表达量可达8.3 mg/L菌液。将真核质粒pcDNA3.1（+）-His-chTNF-α转染COS7细胞,采用抗His标签抗体通过间接免疫荧光（IFA）和WB方法进行鉴定发现chTNF-α蛋白可在COS7细胞中获得表达。2.抗chTNF-α单克隆抗体及多克隆抗体的研制以重组His-chTNF-α蛋白为免疫原免疫新西兰兔,制备兔抗chTNF-α多抗,经三次免疫后,以间接ELISA方法测得兔抗chTNF-α多抗血清效价可达1:51200;以同样的策略免疫6周龄的BALB/c小鼠制备鼠抗chTNF-α单抗。杂交瘤细胞融合后通过IFA和间接ELISA双重筛选,获得10株能够稳定分泌抗chTNF-α的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为 1A11、1C8、1G1、1C11、1C12、1E5、2B5、3E9、3D4、5D10。Ig亚类鉴定结果显示1C11,1C8和3D4为IgG2a,1G1为IgM,其他均为IgG1。间接ELISA测得制备的腹水效价均在1.6×10-4～1.02×10-6之间;WB和IFA结果表明,所有单抗都能特异性地识别原核和真核表达的chTNF-α。通过分段构建chTNF-α-100-179aa,159-233aa、195-285aa到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,分别转染到COS7细胞,应用IFA检测不同单抗与真核表达chTNF-α不同区段的反应,结果显示所有单抗均识别chTNF-α氨基酸序列的195-285区间,同时合成了 chTNF-α 167-196aa的多肽,采用Dot-ELISA检测不同单抗与合成肽段的反应性,结果显示均不反应,与IFA结果相吻合。3.chTNF-α抗原捕获ELISA检测方法的建立采用亲和层析柱纯化抗体;以兔抗chTNF-α多抗为捕获抗体,单抗3E9为检测抗体,建立检测chTNF-α的抗原捕获ELISA方法。经棋盘滴定法确定最佳捕获抗体浓度为10 μg/mL,最佳检测抗体浓度为1:400倍稀释,以重组chTNF-α为标准品做梯度稀释,结果表明本研究建立的ELISA检测方法的最低检测浓度为1 ng/mL。以此法能检测到PMA/Iono刺激的鸡脾脏细中有少量天然chTNF-α蛋白的表达。
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