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褪黑素(Melatonin,MT)是一种神经内分泌激素和高效抗氧化剂,能够通过受体信号途径参与动物的免疫和生殖活动调节。本研究构建了乳腺褪黑素合成酶转基因羊乳腺反应器,并探索了局部褪黑素信号参与炎症反应、排卵和胚胎附植过程的作用机制。本研究成功建立了过表达褪黑素合成酶基因芳香胺N-乙酰基转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase,AANAT)和羟基吲哚-O-甲基转移酶(Hydroxyindole-o-methyl transferase,HIOMT)的转基因绵羊群体,证明褪黑素合成酶基因AANAT和HIOMT可以在羊乳腺上皮细胞中稳定表达,并研究了过表达褪黑素对绵羊抗炎症能力和繁殖效率的影响。以白萨福克和杜泊绵羊为材料,通过CRISPR/Cas9结合显微注射,将特异表达载体pBC1-AANAT和pBC1-HIOMT线性化片段与Cas9 mRNA、sgRNA 一起注射到原核期胚胎内,实现与胚胎基因组整合,最终构建乳腺特异表达褪黑素合成酶转基因绵羊新品系。分别对166只杜泊绵羊和139只白萨福克绵羊供体进行超排,撤栓后50-55h定时进行内窥镜输精,10-12h后冲原核期胚胎。获得杜泊绵羊和白萨福克绵羊胚胎总数分别为1989枚和1455枚;可用胚总数为1989枚和1455枚,平均可用胚分别为11.98枚和10.47枚;经原核胚显微注射后杜泊绵羊存活1728枚,白萨福克存活1321枚,分别移植受体433只和309只,总体妊娠率为杜泊39.03%(169/433)和白萨福克 34.30%(106/309)。通过PCR测序和Southern-blot鉴定出阳性个体,共获得表达AANAT和HIOMT阳性羊87只,其中乳腺特异表达AANAT阳性杜泊绵羊6只,白萨福克7只;HIOMT阳性杜泊绵羊3只,白萨福克6只;AANAT和HIOMT共表达阳性杜泊绵羊28只,白萨福克13只;白萨福克全身表达AANAT绵羊14只,HIOMT绵羊10只;杜泊绵羊阳性率15.54%(37/238),白萨福克阳性率 45.05%(50/111),总体阳性率 24.93%(87/349)。对后代乳腺过表达褪黑素合成酶绵羊进行的系统研究表明:(1)外源基因AANAT和HIOMT通过哺乳期的催乳素诱导,实现在乳腺上皮细胞中高水平表达。(2)转基因阳性个体乳汁中褪黑素水平显著高于野生型,而在血清中两者无差别。说明转入的外源褪黑素合成酶基因,尤其是合成酶AANAT可能仍旧在酶活力方面受到绵羊本身的昼夜节律调控。(3)褪黑素合成酶基因AANAT和HIOMT的转入,并不影响羊血液和乳汁的各项生理生化指标;白细胞、红细胞和血小板等均在正常范围,与野生型羊无显著差别。(4)转基因羊超数排卵效率高于野生型,能够产生更多可用胚;利用内窥镜输精的方式扩繁时有较高的妊娠率和产羔率。(5)LPS模拟攻菌诱导乳房炎的实验发现,LPS能迅速导致乳房炎症状的发生,而乳腺特异表达褪黑素合成酶的转基因羊相比野生型有较强的乳房炎抵抗能力;乳腺中高水平褪黑素促进了白细胞因子IL-2和IL-8水平的降低,并提高了单核细胞的自噬水平,从而减轻了炎症反应。综上所述,克隆得到的褪黑素合成酶基因AANAT和HIOMT能够分别在乳腺特异表达酪蛋白启动子和全身表达的CMV启动子的操纵下,于绵羊体内高水平表达。乳腺过表达载体不带标记基因和原核片段,其过表达的褪黑素合成酶可使转基因绵羊安全地生产高含量褪黑素功能乳。高水平表达的褪黑素不仅能够提高绵羊胚胎移植和繁殖效率,而且还对绵羊自身调节免疫和抵抗炎症具有积极作用。研究为培育高繁抗病绵羊奠定了基础。