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不定根是植物非根组织(如茎、叶)上形成的根。通过不定根发生获得的完整植株可以保持母株的优良性状,同时可以显著缩短繁育周期。因此,扦插成为许多重要农业、园艺和林木等普遍采用的无性繁殖方式。插穗不定根生根性状在林木遗传改良中占有重要的地位。因此,开展林木不定根形成分子调控机制研究具有重要意义。(1)本文中,对大青杨组培茎段进行不同浓度的茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)及其生物合成抑制剂水杨羟肟酸(salicylhydroxamic acid,SHAM)处理,发现0.5-10 μM的MeJA促进大青杨不定根形成,而30-100 μM的SHAM则会显著抑制不定根的发生;(2)对MeJA处理和未处理大青杨组培茎段不定根发生部位的转录组数据比较分析发现,HD-Zip家族的PuHox52在不定根形成早期显著上调表达;(3)亚细胞定位实验结果表明PuHox52定位于细胞核中。转录激活实验证明PuHox52具有转录激活活性,激活区位于其蛋白结构的N端(1-28 aa)。对PuHox52启动子序列的顺式作用元件分析发现,启动子上包含了 8个MeJA响应元件。构建PuHox52pro::GUS载体,对其进行时空表达分析发现,该蛋白在组培茎段基部不定根发生部位诱导表达。QRT-PCR结果显示,PuHox52在伤口胁迫不定根形成前期0～120 h内均上调表达,6 h以内逐渐上调,随后有所下降。NAA、ACC、MeJA和SHAM处理大青杨后,PuHox52表达量只有在SHAM处理后显著下调,而其它激素未引起其改变。进一步说明了PuHox5 可能参与不定根的形成并只受到内源JAs的诱导;(4)与野生型大青杨相比,PuHox52过表达植株(35Spro::PuHox52)会使生根提前1-2天,不定根数量和根的生物量显著提高,不定根变长。而PuHox52抑制表达植株(PuHox52-SRDX,PuHox52-RNAi)会使生根时间推迟1-2天,不定根数量和根的生物量明显减少,根长变短。另外,当使用50 μM SHAM处理PuHox52过表达和抑制表达植株时发现不定根数量并没有明显变化。这说明PuHox52位于JAs信号途径下游来调控不定根的形成;(5)进行PuuHox52过表达株系和WT的组培茎段的不定根发生部位在不定根形成的不同时期的转录组测序。对差异基因进行GO功能注释时发现,有大量基因参与到了伤口和激素响应,根系发生发育等进程。利用差异基因构建了PuHox5 调控的不定根形成多层层级基因调控网络,并从中找到了 15个重要的与植物激素和生长发育相关的PuHo x52靶基因;(6)利用双荧光素酶、EMSA、酵母单杂交和ChIP-qPCR等方法验证了 15个预测的PPuHox52靶基因中,除了 PuZFP14、PuHB13、PuLBD22、PuNAC038、PuHD-like 和PuMYB3 以外,PuHox52 可以与其它 9 基因(PuAGL12、PubHLH137、PuHAT2、PuIAA7、PuLBD21、PuMYC2、PuWRKY51、PuWRKY70和PuIAA14)的启动子相结合,证明了ML-hGRN的可信性较高;(7)QRT-PCR结果显示,大青杨PuHox52靶基因PuAGL12转录水平在PuHox52过表达植株中显著提高,而在PuHox52抑制表达植株中明显下降。PuAGL12表达量还可随着生根时间延长逐渐增加。进一步转基因功能验证试验结果发现,PuAGL12过表达促进大青杨不定根发生。本研究的完成可以为杨树不定根发生分子调控机制的解析和杨树生根能力的遗传改良提供重要的理论基础和基因资源。