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唐鱼(Tanichthys albonubes)为鲤科(Cyprinidae)鱼丹亚科(Danioninae)唐鱼属(Tanichthys Lin,1932)的一种小型鱼类,对生存环境的变化反应灵敏。鱼类的卵黄蛋白原(vtg)已经被公认作为检测环境雌激素的生物标志物。本课题组拟用唐鱼雌激素受体构建表达载体,用唐鱼卵黄蛋白原启动子连接报告基因构建报告载体,建立重组酵母测评系统,其中克隆与分析唐鱼卵黄蛋白原启动子是重要的基础工作。
本文利用Genome Walker PCR和基因组PCR的方法,克隆得到唐鱼卵黄蛋白原基因5’旁侧序列及基因全长。通过网上转录元件搜索系统(TESS),分别对所获得的唐鱼卵黄蛋白原三个基因5’旁侧序进行分析,均具有真核生物启动子序列特征,在转录起始位点上游—25bp处均存在一个TATA框,在TATA框上游存在CAAT框。三个5’旁侧序列都存在与雌激素调控有关的元件1/2ERE、AP1、SP1,以及与肝脏特异性表达有关的元件HNF、C/EBP。三个5’旁侧序列相似性在52%左右,在与斑马鱼vtg的5’旁侧序列比对中,唐鱼vtg promoter1与斑马鱼vtg2的5’旁侧同源性最高,为53.1%;唐鱼vtg promoter2与斑马鱼vtg6的5’旁侧同源性最高,为60.5%;唐鱼vtg promoter3与斑马鱼vtg5的5’旁侧同源性最高,为52%。
唐鱼vtg基因全长约6.9kb,5’末端有14bp非编码区序列,在3’末端有179bp非编码区序列。含有28个外显子和27个内含子,外显子和内含子均比较短,最小的外显子为21bp,最小的内含子为74bp。其中第5个内含子出现了少有的GT/AA边界特征,与其同源性很高的斑马鱼vtg1,vtg5,vtg6,vtg7中也有同样现象。通过全长的比对,唐鱼vtg全长与斑马鱼vtg5,vtg6,vtg7同源性都在70%以上。通过与斑马鱼不同形态的vtg以及其它鱼类vtg基因的对比,发现唐鱼卵黄蛋白原基因与其他物种具有较高的保守性,并且内含子的位置基本上一致,同样遵循GT/AG法则。
本论文共克隆得到三个不同的唐鱼vtg5’旁侧区序列以及唐鱼vtg基因全长序列,推测唐鱼vtg应该和斑马鱼vtg一样具有不同的亚型。