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目的:宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。持续感染高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生密切相关,因此可以通过应用针对HPV感染的预防性疫苗及治疗性疫苗,达到防治宫颈癌的目的。目前全球有四种预防性HPV疫苗获批上市,在未感染HPV的人群中接种预防性HPV疫苗显示出良好的安全性和有效性,但预防性疫苗无法清除已存在的HPV感染,对由HPV持续感染引起的宫颈癌无明显治疗效果。治疗性HPV疫苗旨在通过诱导强劲的HPV抗原特异性Th1型及细胞毒性T淋巴细胞免疫应答,清除HPV感染细胞及HPV恶性转化的肿瘤细胞。由于目前尚无治疗性HPV疫苗批准上市,因此,研发安全有效的治疗性HPV疫苗对于临床治疗HPV感染及相关肿瘤显得尤为重要。在本研究中,首先通过皮下注射途径接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7多肽疫苗,在C57BL/6小鼠TC-1移植肿瘤模型中研究接种疫苗对小鼠系统免疫应答及肿瘤局部免疫应答的影响,明确疫苗对肿瘤生长的抑制作用及机制。肿瘤治疗性疫苗的给药途径是影响疫苗诱导的抗肿瘤活性的关键因素。因此,在第二部分研究中,继续探讨了三种疫苗接种途径（皮下、瘤周和瘤内注射）对以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7多肽疫苗在TC-1移植瘤中诱导的抗肿瘤活性的影响,确定疫苗的最佳接种途径。通过前两部分的研究发现,即使采用相同的疫苗配方、相同的疫苗接种途径,基于HPV 16 E7多肽的治疗性疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应在不同个体之间依然存在很大差异。于是在第三部分研究中,对疫苗诱导的抗肿瘤作用存在显著差异的两组小鼠的肠道菌群进行了系统的比较分析,并进一步探索了免疫细胞与肠道菌群之间的相关性。研究方法:1.应用荷宫颈癌的C57BL/6小鼠研究以CpG ODN作为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗对早期宫颈癌的治疗作用:采用6-8周C57BL/6小鼠,皮下注射TC-1细胞,制备荷瘤小鼠模型。接种TC-1细胞4天后,皮下注射单独的佐剂CpG、单独的E7多肽及CpG与HPV 16 E7 43-77多肽组成的联合疫苗,磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）作为对照。每日观察小鼠的一般状况及肿瘤的生长情况,记录小鼠体重、肿瘤体积和生存期等数据,评估以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗对小鼠肿瘤生长的抑制作用。2.研究以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗对小鼠系统免疫应答及肿瘤微环境的影响:应用流式细胞术检测疫苗对C57BL/6小鼠脾脏CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞、髓源抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）、调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）及肿瘤微环境中CD4+T细胞、CD8+T细胞、MDSC、Treg及肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage,TAM）等免疫细胞的影响;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）评估疫苗对肿瘤组织中的细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）等表达水平的作用;应用免疫组织化学法研究肿瘤组织中细胞增殖、凋亡、血管形成等变化。3.应用荷宫颈癌的C57BL/6小鼠,探讨通过不同途径接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗对中晚期宫颈癌的治疗作用:选择6-8周C57BL/6小鼠,皮下接种5×10~5TC-1细胞,当小鼠肿瘤体积达到150±50 mm~3时,即小鼠接种TC-1肿瘤细胞9天后,将所有小鼠随机分为4组,对照组小鼠皮下注射100μL PBS缓冲液,实验组小鼠分别通过皮下注射、瘤周注射、瘤内注射三种途径接种100μL含20μg佐剂CpG ODN 1826和50μg HPV16 E7 43-77多肽的PBS缓冲液,每天对各组小鼠的一般情况及肿瘤的生长状况进行观察,记录小鼠体重、肿瘤体积和生存期等数据,分析疫苗的不同接种途径对小鼠肿瘤生长抑制作用的差异。4.研究不同途径接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗对小鼠系统免疫应答及肿瘤微环境的影响:应用流式细胞术检测不同途径接种的疫苗对C57BL/6小鼠脾脏抗原特异性CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞、MDSC、Treg、M2-TAM及肿瘤微环境中抗原特异性CD8+IFN-γ+T细胞、MDSC、Treg、M2-TAM等免疫细胞的影响;应用qRT-PCR评估疫苗对肿瘤组织中的细胞因子、趋化因子、MMP等表达水平的作用;应用免疫组织化学法研究肿瘤组织中血管形成、胶原分布等变化。5.研究肠道菌群与以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应的相关性:根据小鼠的肿瘤生长曲线,将小鼠分为肿瘤持续生长的A组和肿瘤体积显著降低的B组,收集两组小鼠新鲜粪便标本,提取粪便基因组DNA,扩增16S rDNA的V3-V4区,并应用Illumina Miseq平台测序;使用物种组成分析、主成分分析、线性判别分析等多种生物信息分析方法比较两组小鼠肠道菌群的差异;应用流式细胞术评估脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、IFN-γ+T细胞、CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞、MDSC、Treg、M2-TAM等免疫细胞;应用Spearman相关分析评价免疫细胞与肠道菌群之间的相关性。结果:1.成功建立荷瘤小鼠模型,接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E743-77多肽疫苗能够显著增强小鼠适应性免疫应答水平,脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞（P=0.0314）、CD8+IFN-γ+T细胞（P=0.0003）占比明显升高,脾脏中MDSC（P=0.0471）、Treg（P=0.0180）等免疫抑制细胞百分比显著降低,进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用,有效抑制小鼠肿瘤生长。2.荷瘤小鼠接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗后,肿瘤局部CD4+T细胞（P=0.0058）、CD8+T细胞（P=0.0018）百分比显著升高,肿瘤微环境中的MDSC（P=0.0401）、Treg（P=0.0004）、M2-TAM（P=0.0371）数量显著降低。qRT-PCR结果显示CpG+E7组肿瘤组织内白细胞介素（Interleukin,IL）-2（P=0.0134）、IL-12（P＜0.0001）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α（P＜0.0001）、IFN-γ（P＜0.0001）等细胞因子及CCL-20（P=0.0159）、CXCL-9（P＜0.0001）、CXCL-10（P=0.0188）、CXCL-14（P＜0.0001）等趋化因子表达水平显著升高。而IL-6（P=0.0063）、IL-10（P=0.0002）、转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）-β（P＜0.0001）等免疫抑制细胞因子表达水平显著降低,CCL-2（P=0.0007）、CCL-3（P=0.0021）、CCL-5（P=0.0154）、CXCL-8（P=0.0001）等趋化因子表达水平显著降低,MMP-2（P＜0.0001）、MMP-9（P=0.0225）等基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）（P=0.0460）的表达水平显著降低。免疫组织化学分析结果显示,CpG+E7组小鼠肿瘤组织中的Ki67（P=0.0157）和p53（P=0.0018）阳性细胞的数量显著降低,且肿瘤组织中的血管生成数目明显减少（P＜0.0001）。总之,接种以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7多肽疫苗,降低了全身和肿瘤局部免疫抑制,并诱导了强大的抗肿瘤免疫反应,最终抑制了移植瘤的生长。3.荷瘤小鼠对疫苗的不同免疫接种途径诱导的抗肿瘤反应存在差异。瘤内注射疫苗进行免疫治疗的中晚期荷瘤小鼠,肿瘤体积显著降低（P＜0.0001）。瘤内注射组小鼠脾脏中HPV 16 E7特异性的CD4+IFN-γ+T细胞（P=0.0453）、CD8+IFN-γ+T细胞（P=0.0281）占比明显升高,脾脏中MDSC（P=0.0211）、Treg（P=0.0040）、M2-TAM（P=0.0015）等免疫抑制细胞百分比显著降低。4.瘤内注射疫苗会促进肿瘤局部HPV 16 E7抗原特异性的CD8+IFN-γ+T细胞的募集和激活（P=0.0231）,减少包括MDSC（P=0.0002）、Treg（P=0.0167）和M2-TAM（P=0.0024）在内的免疫抑制细胞浸润,从而有效增强抗肿瘤免疫应答水平。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,瘤内注射组肿瘤组织中IL-2（P=0.0005）、IL-12（P＜0.0001）、TNF-α（P＜0.0001）、IFN-γ（P=0.0001）等促炎抗肿瘤细胞因子及能够促进效应T细胞和自然杀伤（Natural killer,NK）细胞向肿瘤局部迁移的趋化因子CXCL-9（P＜0.0001）和CXCL-10（P=0.0325）mRNA表达水平显著提高,瘤内组IL-10（P=0.0030）、TGF-β（P＜0.0001）、CXCL-1（P=0.0014）、MMP-2（P=0.0254）、MMP-9（P=0.0373）、VEGF（P＜0.0001）的表达水平显著降低。免疫组化结果表明,疫苗的瘤内注射显著增加了肿瘤组织内CD4+（P=0.0080）和CD8+（P=0.0006）T细胞的密度,肿瘤组织中的血管生成数目明显减少（P=0.0124）,α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）分子的表达水平明显降低（P=0.0108）。5.与A组小鼠相比,疫苗接种在B组小鼠体内诱导了更强的抗肿瘤活性,分泌IFN-γ的CD4+（P=0.0385）和CD8+（P=0.0102）T淋巴细胞显著增多,MDSC（P=0.0089）、Treg（P=0.0005）和M2-TAM（P=0.0005）等免疫抑制细胞明显减少。6.肠道菌群分析结果显示,两组小鼠肠道菌群的细菌丰富度和多样性具有相似水平,CD8+T细胞的百分比与Corynebacteriales（P=0.0069）、Parabacteroides（P=0.0206）和Bacteroides＿sp.（P=0.0141）的相对丰度之间存在Spearman正相关关系。此外,CD4+和CD8+T细胞的百分比与Proteobacteria（P=0.0188,P=0.0104）和Bilophila（P=0.0223,P=0.0081）的相对丰度呈Spearman负相关关系。相反,Proteobacteria（P=0.0055、P=0.0147、P=0.0017）、Desulfovibrio（P=0.0266,P=0.0110,P=0.0178）和Bilophila（P=0.0063,P=0.0037,P=0.0075）的相对丰度与MDSC、Treg和M2-TAM的百分比呈Spearman正相关关系。Bacteroides＿sp.（P=0.0475、P=0.0123、P=0.0003）的相对丰度与三种免疫抑制细胞的百分比呈Spearman负相关关系。结论:1.皮下注射以CpG ODN为佐剂的HPV 16 E7 43-77多肽疫苗可抑制小鼠早期宫颈癌的生长;疫苗接种增加CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞的数量以及肿瘤局部IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ的水平;疫苗接种降低MDSC、Treg等免疫抑制细胞的数量以及肿瘤局部IL-10、TGF-β、MMP-2、MMP-9的水平。2.瘤内注射疫苗通过增强HPV抗原特异性抗肿瘤免疫应答,改善肿瘤局部免疫抑制微环境,显著抑制晚期宫颈癌的生长,是相较于皮下注射和瘤周注射更优的疫苗接种途径。3.肠道菌群组成与疫苗诱导的抗肿瘤效应相关,部分肠道细菌与疫苗诱导的免疫应答之间存在相关性。