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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,m TOR)能够调节细胞的生长。m TOR能够组成两种功能复合物:m TORC1和m TORC2,其中m TORC1能够通过其上游多种“感受器”感受细胞内外的一系列信号变化,包括能量状态、生长因子和激素、营养因子等,来调节细胞内蛋白质合成和降解,从而调控细胞生长。营养因子中,氨基酸既是蛋白质合成的必需底物,也是m TORC1活性调节的必要的信号分子。在氨基酸中,亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸被认为能有效调节m TORC1活性。且氨基酸转运感受体参与氨基酸依赖性的m TOR活性调节过程。近几年研究发现一种G蛋白偶联受体T1R1/T1R3(Taste Receptor Type 1subtype1/3,T1R1/T1R3)能够作为广谱性的氨基酸感受体感应胞外氨基酸,通过促进胞内Ca2+增加激活ERK1/2来参与调控m TOR。然而目前研究主要针对胞外总的氨基酸,究竟哪些氨基酸参与该过程并不清楚,因此T1R1/T1R3介导调控m TOR信号是否具有氨基酸特异性及其调控机制有待进一步阐明。本课题研究内容由两部分组成,本实验以C2C12小鼠成肌细胞作为研究对象,第一部分在确定T1R1/T1R3对m TOR信号具有调控作用的基础上,筛选由T1R1/T1R3介导的调控m TOR信号的胞外氨基酸。第二部分进一步探索T1R1/T1R3参与氨基酸依赖性的m TOR活性调节的机制及其特异性。第一部分主要结果如下:1、Q-PCR方法测定2%马血清诱导的C2C12细胞分化0、2、4、8天,T1R1/T1R3的表达情况。研究发现T1R1/T1R3在小鼠C2C12成肌细胞诱导分化过程中有表达。2、C2C12成肌细胞中T1R1/T1R3能介导氨基酸调控m TOR信号。在有氨基酸存在的情况下,利用信号通路抑制剂及激动剂处理细胞,Western blot方法测定p-S6K1、p-m TOR磷酸化水平的变化,鉴定T1R1/T1R3对蛋白质合成的作用,并筛选出最佳抑制剂浓度。研究发现Ca2+螯合剂BAPTA-AM及ERK1/2活性抑制剂U0126都能极显著抑制氨基酸诱导的m TORC1的激活(P<0.01),且具有浓度依赖性效应。T1R1对氨基酸的特异性增强剂IMP预处理细胞则能显著增加氨基酸诱导的m TORC1的激活(P<0.05)。并且BAPTA-AM浓度为10μmol/L,U0126浓度为15μmol/L,即能达到极显著抑制效果。说明C2C12成肌细胞内T1R1/T1R3也能介导氨基酸通过促进胞内Ca2+升高及激活ERK1/2来参与调控m TOR信号。3、蛋氨酸参与T1R1/T1R3介导调控蛋白质合成。不同氨基酸处理细胞后,Western blot方法测定p-S6K1、p-m TOR磷酸化水平的变化、SUn SET非放射性方法检测蛋白质合成速率、Q-PCR检测蛋白质降解标志基因,筛选出参与T1R1/T1R3介导的调控m TOR信号的胞外氨基酸。研究发现七种能引起胞内Ca2+增加的氨基酸(50mmol/L)中只有蛋氨酸能极显著激活m TORC1(P<0.01),蛋氨酸能极显著促进蛋白质合成速率,该过程依赖于m TOR,并且能极显著抑制蛋白质降解途径关键基因Atrogin-1、Mu RF-1的m RNA表达水平(P<0.01)。说明参与T1R1/T1R3介导的调控m TOR信号的胞外氨基酸主要为蛋氨酸,表明蛋氨酸可能成为研究氨基酸受体T1R1/T1R3介导调控m TOR信号的主要氨基酸。第二部分主要结果如下:1、蛋氨酸能被T1R1/T1R3介导通过促进胞内Ca2+增加激活ERK1/2,从而调控m TOR活性。在有蛋氨酸诱导的情况下,利用信号通路抑制剂及激动剂处理,Fluo-8检测胞内Ca2+变化,Western blot方法测定p-S6K1、p-m TOR磷酸化水平的变化、SUn SET非放射性方法检测蛋白质合成速率,验证C2C12成肌细胞中蛋氨酸调控m TOR信号的分子机制。研究发现Met能促进胞内Ca2+增加,Ca2+螯合剂BAPTA-AM、PLC特异性抑制剂U73122、ERK1/2活性抑制剂U0126都能极显著抑制蛋氨酸诱导的m TORC1的激活(P<0.01),T1R1/T1R3对氨基酸的特异性增强剂IMP则能显著增加蛋氨酸诱导的m TORC1的激活(P<0.05)。说明蛋氨酸能激活m TORC1,且蛋氨酸调控m TOR依赖于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号转导途径。2、ERK1/2在T1R1/T1R3介导氨基酸调控m TOR中具有一定作用。Western blot检测通路关键蛋白p-ERK1/2的水平,验证ERK1/2活性对蛋氨酸调控m TOR的重要性。研究发现BAPTA-AM处理能极显著增加蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平(P<0.01),且具有浓度依赖性效应,与p-S6K1变化水平相反。IMP处理则能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平,U0126处理抑制ERK1/2活性则能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平。3、T1R1/T1R3介导氨基酸调控m TOR信号具有氨基酸特异性。利用不同类型氨基酸处理细胞,Western blot检测通路关键蛋白水平的变化,探索T1R1/T1R3介导氨基酸激活m TORC1的氨基酸特异性。研究发现蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸五种氨基酸处理细胞,随着氨基酸浓度增加,蛋氨酸及亮氨酸能诱导通路关键蛋白的水平逐渐增加,而谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸诱导则无显著变化。亮氨酸激活m TORC1也依赖于胞内Ca2+及ERK1/2。证实T1R1/T1R3调控m TOR信号的主要是蛋氨酸,其他氨基酸效果不显著。综上所述,本研究的结论是:1、参与C2C12成肌细胞T1R1/T1R3介导的调控m TOR信号的胞外氨基酸主要为蛋氨酸。2、蛋氨酸激活m TORC1依赖于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号转导途径。T1R1/T1R3介导氨基酸通过T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号转导途径调控m TOR具有氨基酸特异性。