中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)是一种目前新发现的最大的RNA病毒，具有致病性强、致死率高的特点，其感染和传播给人类带来了新的挑战。但是，目前关于MERS-CoV的致病通路的有关研究很少。microRNA（miRNA）作为一类新型的调控因子，在病毒致病过程中起到非常重要的作用。本课题从miRNA角度对MERS-CoV的致病通路进行了研究，有利于进一步阐明MERS-CoV与宿主之间的相互作用，并为发现抗MERS-CoV的药物提供新的靶点和策略。　　研究目的:探索体内重要调控分子miRNA在MERS-CoV致病过程中的作用及相关调控分子机制。　　研究方法:　　1.MERS-CoV感染后的致病通路探索:①MERS-CoV感染致病相关miRNA筛选:预测分析可能在MERS-CoV感染致病过程中具有重要作用的miRNA。通过MERS-CoV感染的细胞miRNA表达谱芯片的差异分析，选择信号值有明显变化的miRNA，利用MTT实验筛选出可能在MERS-CoV感染致病过程中具有重要作用的miRNA，qPCR验证MERS-CoV感染后该miRNA在胞内的表达。②检测miR-374a对细胞增殖的影响:将miR-374a mimics瞬时转染入细胞，利用MTT实验检测 miR-374a的过表达对细胞增殖的影响。③预测分析miR-374a可能靶向的靶基因:通过MERS-CoV感染的细胞mRNA表达谱芯片的差异分析，综合在线分析(Targetscan，pichtar)等方法预测miR-374a的靶基因，取预测交集，预测到miR-374a可能靶向BolA33UTR，qPCR验证分析的结果。④通过qPCR和Western blotting实验方法检测了miR-374a在mRNA和蛋白质水平上对BolA3表达的影响。⑤miR-374a对BolA3的靶向性研究:构建含有BolA33UTR的报告基因载体，与miR-374a过表达载体共转染入细胞，通过双荧光素酶报告基因检测miR-374a对BolA33UTR的靶向性。　　2.BolA3基因的克隆表达及特异性抗体制备:为了研究BolA3在细胞中的功能，需要进行细胞中BolA3蛋白表达检测，因为没有用于表达检测合适的市售抗体，我们制备了BolA3的多克隆抗体。①基因克隆:从人肺癌细胞系A549细胞中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出BolA3基因。②载体构建:将克隆基因构建入pQE30原核表达载体中。③蛋白诱导表达:在大肠杆菌中诱导蛋白表达，Western blotting方法鉴定带有His标签的重组BolA3蛋白，分析蛋白表达形式。④蛋白纯化:使用Ni柱亲和层析法纯化该蛋白。⑤抗体制备:程序免疫大耳白兔，耳缘静脉采血分离免疫后兔血清，ELISA方法检测血清中抗体滴度。⑥抗体鉴定:通过Western blotting方法，检测制备的抗体与原核及真核表达的BolA3蛋白结合特异性。　　3.BolA3在细胞中的定位分布及对ATP生成的研究:①蛋白在各细胞系中的表达:培养多种肺、肝、肾、脑等细胞系，裂解细胞，蛋白电泳，通过Western blotting方法利用制备的多克隆抗体检测多种细胞系中BolA3的内源性表达。②真核表达载体构建:PCR扩增出BolA3基因片段，构建入pMD18-T载体，双酶切从pMD18-T上切下BolA3基因片段，构建入相同酶切的pEGFP-C1载体中。③蛋白定位:构建的EGFP-BolA3融合表达的真核表达载体，瞬时转染入细胞内，检测到绿色荧光的表达。通过激光共聚焦实验检测绿色荧光的细胞与不同定位荧光标记的共定位情况，检测BolA3的细胞定位。④BolA3表达抑制对细胞功能的影响:建立BolA3抑制模型，筛选BolA3 RNAi的有效区域，构建重组表达BolA3 RNAi腺病毒，感染细胞后定量PCR法和Westem-Blotting方法检测细胞内BolA3的表达抑制情况，MTT实验检测感染上述腺病毒抑制细胞内BolA3表达后，对细胞增殖的影响。利用荧光法检测抑制细胞内BolA3表达对细胞ATP生成的影响。　　研究结果:　　1.在中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的细胞的表达芯片进行差异筛选中发现:①MERS-CoV引起miRNA差异表达谱分析，筛选出7个信号值有明显上升的miRNA，并从中筛选出1个可能在MERS-CoV感染致病中有重要作用的miRNA miR-374a，通过qPCR验证了MERS-CoV能够促进细胞内miR-374a的表达;②功能实验检测证明miR-374a在细胞中过量表达可以抑制细胞的增殖;③在MERS-CoV影响miR-374a表达的研究中发现，miR-374a可能靶向调控BolA33-UTR。分析该分子可能在MERS-CoV感染致病通路中起到重要作用;④qPCR方法对MERS-CoV在细胞中调控BolA3表达进行了鉴定，结果显示MERS-CoV感染细胞后，能够抑制细胞内BolA3;⑤miR-374a靶向BolA3的鉴定:qPCR和Western blotting实验验证了miR-374a能够在mRNA和蛋白质水平上抑制BolA3的表达;荧光素酶检测报告基因结果说明miR-374a能够靶向抑制BolA33UTR。　　2.BolA3蛋白在细胞中的功能研究:①抗BolA3多克隆抗体制备和鉴定:转化构建的BolA3原核表达载体入M15感受态，诱导蛋白表达，利用纯化获得的蛋白程序免疫大耳白，获得免疫后兔血清，Western blotting方法鉴定所制备抗体对原核及真核表达BolA3蛋白的结合具有高度特异性;②使用制备的抗体检测到BolA3在人肺、神经、肝和肾细胞系中均有内源性表达，提示其在机体的功能广泛;③将成功构建的EGFP-BolA3融合表达的真核表达载体pEGFP-C1-BolA3瞬时转染入细胞，激光共聚焦实验，检测到BolA3蛋白与线粒体标记物共定位于线粒体和细胞核;④建立BolA3抑制模型，制备重组表达BolA3 RNAi腺病毒，感染细胞，检测其可以有效抑制细胞内BolA3的表达。使用腺病毒感染细胞，检测到抑制BolA3的表达能够促进细胞进行性死亡。对其机制进行研究发现:抑制细胞内BolA3的表达能抑制细胞内能量代谢中的重要分子--ATP的生成。　　研究结论:　　1.本研究对miRNA在中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染致病过程中的作用进行了探索。实验结果显示MERS-CoV感染细胞可以影响多种宿主细胞miRNA的变化，其中MERS-CoV感染可通过促进细胞内miR-374a的表达而靶向抑制BolA3的表达，从而影响细胞生存。　　2.针对miR-374a的靶基因，本研究对BolA3基因在细胞中的分布、定位及其对ATP生成的影响进行了研究。研究结果表明BolA3在肝脏、肾脏、肺和脑等多种细胞内均有表达，而且BolA3的表达能够定位于细胞线粒体。我们利用神经细胞模型进行的实验研究显示，BolA3表达的下降会影响细胞内能量代谢的重要物质ATP的形成，进而影响细胞的生存。实验研究提示MERS-CoV感染导致BolA3表达下降可能在MERS病毒感染致病中发挥一定的作用。