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目的基于TLR4介导的MyD88依.赖信号通路和TRIF依赖信号通路,并结合药效动力学模型和中位效应方程定量地评价大黄酸、大黄素、芦荟大黄素体外抗炎的分子机制与量效关系,进一步明确大黄蒽醌类化合物抗炎活性与分子结构关系的科学内涵。方法1.采用MTT法检测大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对RAW 264.7巨噬细胞活性的影响,从而明确三种药物在该细胞系中的安全浓度范围,并确定实验浓度。2.采用预给药实验方案。大黄酸（80μM、40μM、20μM）、大黄素（80μM、40μM、20μM）、芦荟大黄素（20μM、10μM、5μM）分别与RAW 264.7巨噬细胞预孵育30 min后,加入LPS（终浓度1μg/mL）刺激,以LPS加入时间为“零”时间点。在0、5、15、30、60、90、120 min后,取细胞裂解液采用Western blot检测IKKβ、TBK1蛋白及其磷酸化蛋白的表达;0、10、30、60、120、240min后取细胞裂解液,Western blot检测NFκB p65、PI3K、IRF3蛋白及其磷酸化蛋白的表达;0、1、2、4、8、12、24 h后,取细胞裂解液采用Western blot检测iNOS蛋白表达,取细胞上清液采用Griess法检测NO浓度以及采用Elisa试剂盒检测IL-6、TNF-α、IFN-β、IFN-γ。从而考察大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对LPS诱导的TLR4-MyD88/TRIF依赖信号通路中上游蛋白以及下游炎性因子与干扰素动态变化的调控作用。3.采用Monolix?2016R1软件建立药效学模型,定量地捕捉大黄酸、大黄素、芦荟大黄素体外抗炎的动态变化与分子机制;同时三个药物分别设置七个浓度剂量组,取上清液分别用于检测IL-6和NO,并计算中位效应方程。结合药效学模型与中位效应方程,明确三种化合物的体外抗炎的量效关系与效价强度。4.分析对比大黄酸、大黄素、芦荟大黄素分子疏水性系数（logP）、极性/非极性去溶剂化能、拓扑极性表面积、分子表面静电势以及穿透磷脂双分子层的过量自由能,与药效学研究关联分析对比,从而揭示大黄蒽醌类化合物体外抗炎与分子结构关系（构效关系）的实质。结果1.0.1μM100μM大黄酸、大黄素以及0.1μM40μM芦荟大黄素在RAW264.7巨噬细胞为安全浓度范围,确定大黄酸、大黄素实验浓度分别为80、40、20μM,芦荟大黄素实验浓度为20、10、5μM。2.LPS可激活RAW 264.7细胞中MyD88依赖信号通路和TRIF依赖信号通路,且所涉及的上游蛋白表达以及下游末端因子的生成均有各自独特的动态变化。IKK-β在LPS刺激5 min后快速磷酸化并达到最高表达水平;NF-κB p65磷酸化水平在LPS刺激后的10 min即可检测到升高,随后逐渐减弱,在120 min时其磷酸化水平再度升高,其磷酸化水平呈振荡曲线趋势;PI3K在LPS刺激后60min迅速升高,并随时间增加而升高;TBK1在LPS刺激后的30 min可检测其磷酸化水平升高,并随时间推移而持续升高;IRF3在LPS刺激后60 min磷酸化水平显著升高,且进入平台期,在60240 min内其磷酸化水平趋于稳定;iNOS蛋白表达水平在LPS刺激后的8 h显著升高,且在8 h24 h内持续升高;细胞上清液中NO的浓度在LPS刺激后的8 h24 h持续升高;细胞上清液中IL-6浓度在LPS刺激后的2 h8 h内显著升高,在8 h24 h其浓度趋于稳定;细胞上清液中TNF-α在LPS刺激后的0 h2 h内陡然升高,在4 h24 h其浓度略有降低且趋于平稳;细胞上清液中未检测到IFN-γ、IFN-β。3.大黄酸、大黄素、芦荟大黄素均可抑制LPS刺激引起的MyD88依赖信号通路和TRIF依赖信号通路的激活,可剂量依赖地下调IKKβ、NFκB p65、PI3K、TBK1、IRF3磷酸化水平,抑制下游iNOS的表达,以及NO、IL-6的分泌。同时观察到大黄蒽醌类化合物对TNF-α的分泌略有上调作用,这与IKKβ的双向调节作用有关。4.中位效应方程的结果表明,三种药物在相同浓度下,芦荟大黄素对IL-6以及NO生成的抑制率均强于大黄素、大黄酸。大黄酸、大黄素、芦荟大黄素抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞生成IL-6的IC50为100.92μM、39.81μM、18.84μM,而抑制NO生成的IC50为53.12μM、46.80μM、17.83μM;药效动力学模型结果表明,大黄蒽醌化合物治疗该体外炎症的药效动力学模型为双靶点抑制模型,对NF-κB p65磷酸化和iNOS蛋白表达均有抑制作用,其中对NF-κB p65磷酸化的对数线性抑制系数为0.0125、0.0208、0.0410,对iNOS蛋白表达的对数线性抑制系数分别为0.0142、0.0587、0.0763,显然对iNOS蛋白表达的抑制作用强于对NF-κB p65磷酸化的抑制作用（约两倍）。中位效应方程与药效动力学模型结果均表明,三种蒽醌化合物体外抗炎机制相同,但具有不同的效价强度:芦荟大黄素>大黄素>大黄酸。但由于溶解度的限制,芦荟大黄素的效能低于大黄素、大黄酸。5.构效关系分析结果表明,三种蒽醌化合物的疏水结构是引起抗炎效价强度差异的主要原因。与大黄素、大黄素、芦荟大黄素结合的受体具有疏水口袋,芦荟大黄素分子结构的疏水作用最强,故其与受体的结合能力亦强于大黄素、大黄酸,从而表现出更强的抗炎能力。结论大黄蒽醌类化合物大黄酸、大黄素、芦荟大黄素可剂量依赖地抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞引起的炎症,其作用机制为双靶点抑制（NF-κB p65和iNOS）。相同剂量下,芦荟大黄素的抗炎作用强于大黄素、大黄酸。三种蒽醌化合物抗炎能力的差异主要源自其分子结构支链引起的疏水作用差异,与蒽醌类化合物结合的受体具有疏水口袋,芦荟大黄素分子结构的疏水作用强于大黄素、大黄酸,故具有更强抗炎效价强度。