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目的一、大黄蒽醌类成分提取工艺研究二、大黄蒽醌类成分泄下作用及机理研究三、大黄游离蒽醌结肠靶向胶囊药效学研究四、大黄蒽醌类成分药代动力学研究方法1、将大黄研磨过24目筛,采用稀硫酸水解氯仿同步萃取法进行游离蒽醌类成分提取,提取液回收氯仿得到粗提物,粗提物用乙酸乙酯重结晶的到纯化的大黄游离蒽醌提取物。另将大黄粉末用95%乙醇回流提取,过滤,用氧化镁吸附法去鞣质,得总蒽醌提取物。总蒽醌提取物再经过氯仿萃取水相部分为大黄结合蒽醌。分别将结合蒽醌和总蒽醌提取物在稀硫酸-氯仿混合液中回流水解提取1 h,重复2次,合并氯仿液,用无水硫酸钠除水分、浓缩干燥,将水解产物用甲醇定容,进HPLC测定并计算含量。取游离蒽醌提取物直接用甲醇定容,进HPLC测定并计算含量。2、健康Wistar大鼠,SPF级,雌性,体重180-220 g,乙醚麻醉,开腹,将PVC导管植入盲肠,游离端固定于动物的颈部,术后动物单笼饲养3天后用于实验。盲肠插管动物按体重随机分成4组即：游离蒽醌组、结合蒽醌组、总蒽醌组、阴性对照组。以酚红作为指示剂（10 mg/0.4mL）,经盲肠导管给予含酚红的受试药物或生理盐水0.4 mL/只。分别在盲肠给药后2、4、6、10、14、20、24 h收集大鼠粪便,称湿重。将大鼠粪便在100℃的温度下烘干,称干重。从给药时刻计起,观察动物首次出现带色粪便的时间并记录LIT值并计算粪便的水分含量。另将雌性Wistar大鼠,实验前禁食16h不禁水。试验前按体重随机分成4组即：游离蒽醌组、结合蒽醌组、总蒽醌组、阴性对照组。动物用乙醚麻醉,暴露从盲肠到直肠的整个大肠,接蠕动泵用温生理盐水30 mL冲洗肠道,在两端结扎的结肠内注射37℃的Tyrode溶液或含蒽醌类成分的Tyrode溶液2 mL（Tyrode组成：g/L, NaCl 8.0, KCl 0.2, CaCl2·6H2O 0.2, MgCl2·6H2O 0.1, NaHCO31.0, NaH2PO4 0.05,糖2.7）。给药后1h处死动物,切除整个结肠段,对结肠内潴液进行体积测定,再将结肠潴液离心3000 rpm,10 min,分离上清液进行电解质含量测定。3、将Wistar雌性大鼠,实验前禁食16 h,不禁水,动物按体重随机分组,用PCcaps-kit胶囊灌胃针给大鼠灌胃结肠靶向胶囊（5粒/只,酚红10mg/粒）,给予胶囊后每隔3h给动物灌胃饮用水0.5 mL。分别在给予胶囊后不同时间处死动物,观察胶囊在胃肠道内的位置并计数,以肠道内容物红染作结肠靶向胶囊降解指标,考察结肠靶向胶囊在胃肠道内的转运及其稳定性。另将Wistar雌性大鼠按体重随机分4组,结肠靶向胶囊内充填酚红作为指示剂（10 mg/粒）,用PCcaps-kit大鼠胶囊灌胃针给大鼠灌胃给予含酚红和受试药物的结肠靶向胶囊（2粒/只）,游离蒽醌给药剂量为低剂量12 mg/kg、中剂量24 mg/kg和高剂量48mg/kg。给药后立即计时,观察动物首次出现带色粪便的时间并记录LIT值。4、采用HPLC结合浊点萃取法测定大鼠血浆中的芦荟大黄素，大黄素和大黄酚。使用非离子型表面活性剂Triton X-114作为萃取溶剂,甲醇和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,以Kromasil C18为分析柱,柱温40℃,检测波长254 nm。结果1、大黄游离蒽醌、结合蒽醌、总蒽醌提取物的含量和提取率分别为59.5%、14.8%、18.6%和0.57%、2.03%、2.49%。2、与阴性对照组相比,游离蒽醌和总蒽醌给药组动物的LIT明显缩短（p<0.01）,而结合蒽醌组与阴性对照组相比无显著性差异（p>0.05）。与阴性对照组相比,游离蒽醌和总蒽醌给药组动物粪便含水量在给药后24 h内均有明显增加（p<0.01）,且游离蒽醌组明显高于总蒽醌组,而结合蒽醌组与阴性对照组相比无明显差异（p>0.05）。同阴性对照组相比,游离蒽醌和总蒽醌给药组动物结肠内的水分及K+、Na+、C1-的量均明显增加（p<0.05）,而结合蒽醌组同阴性对照组相比无明显差异（p>0.05）3、结肠靶向胶囊在动物体内到达盲肠之前基本不溶解,在结肠部位迅速溶解释放。大黄游离蒽醌大鼠结肠靶向胶囊高剂量组LIT值与阴性对照组相比有显著性差异（p<0.05）,中低剂量组与阴性对照组对比分析无显著性差异（p>0.05）。大鼠给予结肠靶向胶囊后的观察期（11-23 h）内,阴性对照组动物粪便含水量均值为58.38±6.64%，游离蒽醌给药高剂量组含水量均值为72.13±5.55%,中剂量组水分含量均值为66.60±5.52%,低剂量组水分含量均值为66.17±5.52%,在9-13h内,高、中剂量组水分含量与阴性对照组对比有显著性差异（p<0.01）,且17h时高剂量组水分含量仍高于阴性对照组（p<0.05）；而低剂量组与阴性对照组对比无显著性差异（p>0.05）。4、芦荟大黄素,大黄素,大黄酚分别在0.117-15μg/mL、0.258-16.5μg/mL和0.126-16.2μg/mL的范围内线性良好（r2>0.9997）,最低检测限低于24 ng mL-1（S/N=3）；最低定量限低于38 ngmL-1（S/N=10）。3种成分的日内、日间精密度分别为2.85%、3.27%、4.84%和5.38%、6.01%、5.12%；回收率均大于93.6%。它们的药动学特征符合二室开放模型并在0.17 h达到了最高峰浓度,血药浓度分别为3.44μg·mL-1、6.04μg·mL-1和1.95μg·mL-1。结论1、同步酸水解氯仿提取方法能够较好的提高大黄提取物中游离蒽醌类的含量,游离蒽醌的含量高于文献报道。2、研究结果显示大黄游离蒽醌和总蒽醌成分结肠给药均具有泄下作用,但结合蒽醌基本与阴性对照组无异。因此,可以认为大黄结肠给药发挥泄下作用的主要成分为蒽醌苷元。大黄游离蒽醌结肠给药产生泄下作用的机制主要是：加快结肠的转运能力,缩短肠内容物在结肠的转运时间；增加结肠内水分及电解质Na+、K+、Cl-的量,增大肠腔容积。3、大黄结肠靶向胶囊在胃及小肠内稳定,在结肠部位开始降解,具有结肠靶向性。大黄游离蒽醌结肠靶向胶囊具有加快结肠转运和增加结肠内水分的作用,且其泄下作用具有剂量依赖性。4、浊点萃取法简便、环保、快捷,适用于芦荟大黄素、大黄素和大黄酚在大鼠体内血药浓度的测定。