前言近年来,由于副作用较小的新型抗生素的发展应用,氨基糖甙类抗生素(Aminoglycoside Antibiotics, AmAn)的使用率已经明显下降。然而,在肠球状菌,分枝杆菌以及严重的革兰氏阴性细菌感染的治疗中,AmAn仍然占据着主导地位(Swan,1997;Edson and Terrell,1999).在20世纪80年代,每年有二百万的美国患者接受AmAn的治疗。目前对绝大多数临床听觉损害的发病率的评估,实际上提供的只是保守的数据。听力损害从较高的听觉频率开始(在人类,为16-18kHz),但在临床实际监测常常仅能达到8kHz,而且由于干扰噪声,听力检测也很困难。即便如此,研究结果仍然显示,在绝大多数情况下,使用AmAn所产生的耳蜗毒性的发生率可以达到患者总数的20%；而前庭平衡功能受到影响的发生率可达到15%(Fee, et al,1980;Moore et al.,1984;Lerner et al.,1986)AmAn耳毒性的问题在发展中国家就更为普遍,这类药物因其高效性及低成本消耗而成为发展中国家最频繁使用的药物之一。诸如：监测血清药物水平或者听觉功能,这些预防AmAn耳毒性作用的安全措施,在这些国家实际上是很难普及应用的。因此,在这些国家中由AmAn耳毒性作用导致的听觉损害的发病率估计要明显比从发达国家所得到20%的比例高得多。有研究表明,在中国的南方地域内所有聋哑患儿中,大约有2/3的儿童是由于使用AmAn所致。近年来在全球范围内再现的肺结核(Shafer et al.,1989)是AmAn药物广泛使用的又一个重要原因。肺结核由于是通过空气传播感染的,近年来它的发病率呈上升趋势,据WHO的估计,肺结核将是近十年最肆虐的致命疾病,而它的传播也是与多药物耐药性菌株的出现有关,在治疗过程中必须采用的联合用药,AmAn(最常用的是链霉素和阿米卡星)则是其中不可缺少的组成药物。研究发现,在肺结核患者中,卡那霉素导致的听觉损害占患者总数的80%(Brouet et al.,1959).因此,在我们这个发展中国家有必要继续深入认识和了解AmAn的耳毒性机制,期望最终能够减弱甚至消除它的耳毒性副作用,治疗或防止AmAn的耳毒性所导致的听觉功能损害,更好地发挥这类药物价格低廉、高效抗菌、不易产生耐药性的优点。目前,关于AmAn耳毒性的研究认为,在全身给药时,会引起耳蜗的毛细胞,螺旋神经节细胞,以及前庭毛细胞的损害,导致细胞的变性、凋亡、缺失,耳蜗的感觉上皮最终可能完全被非特殊分化的鳞状上皮所替代,由此引起不可逆性的听觉损害。在大多数情况下,用药的剂量和用药的时间决定耳毒性损害的范围和严重程度;另外一个主要的影响因素是受治疗者的营养和生理状态；此外,肾功能的损害也是影响因素之一,肾功能损害限制了AmAn排泄,因此导致AmAn在体内的蓄积,增加其产生耳毒性的机率；药物与药物之间的相互作用也能产生较大的耳毒性危险,如袢利尿剂：利尿酸,与AmAn的联合用药会大大增加AmAn的耳毒性作用；除此之外,某些携带家族性突变基因的易感人群,妊娠,发育中的婴儿等等,都是容易导致耳毒性发生的因素。这些易感因素目前对预防AmAn耳毒性的发生具有一定的指导作用。AmAn耳毒性作用所引起的耳蜗内组织细胞的病理性改变最先发生在基底膜上的外毛细胞,而将声音刺激的机械信号转换为听觉传入神经上的听觉信号的直接转换器—内毛细胞,其病理性改变要远在外毛细胞之后,因此外毛细胞的形态和功能在AmAn耳毒性作用过程中的变化一直是AmAn耳毒性机制的研究重点。2000年,Zheng Jing等在耳蜗外毛细胞基底部外侧膜上发现了一种新颖奇特的马达蛋白—Prestin,这种蛋白质不同于以往传统的马达蛋白(如：myosin, kinesin, dynein等),它不依赖ATP和Ca2+,可完成直接的、迅速的、可逆的电压依赖性的构象的改变,从而引起外毛细胞的细胞体随着膜电位的变化而产生机械运动(膜去极化时缩短,超极化时伸长)。Prestin蛋白的这种电能动性(electromobility)正是耳蜗放大器的驱动力,可以对基底膜运动实现主动的反馈性调制,实现了耳蜗放大器作用,可使听觉敏感性提高约100倍,这种机制使哺乳动物的听觉具备了高度的敏感性,广阔的听觉域,敏锐的频率选择性。实验证实,敲除Prestin基因的小鼠听觉阈值升高40-60dB SPL。研究认为,Prestin蛋白包括两个结构域：(1) "voltage sensor"能够检测细胞膜跨膜电位改变的电压感受器—存在于胞质中的有作用的一价阴离子(氯离子)。(2) "actuator"促进构象改变从而便于细胞在去极化和超极化时,分别发生缩短和伸长反应的调节器。正常细胞中,在分子亲和力的作用下,胞内的阴离子(氯离子)与快蛋白的一个位点结合后,膜电位的改变引起氯离子的“跨膜转运”。超极化时朝向细胞外表面运动,去极化时,向胞质侧运动。转运触发了蛋白质构象及其在细胞膜平面的表面积的改变。简单说,超极化时表面积可增加,使细胞伸长；去极化时Prestin蛋白沿细胞表面可压缩,从而使细胞变短。但快蛋白是一个不完全的转运体,它不允许被转运的阴离子(氯离子)扩散或离开到胞外的空间中去而仅在膜内两侧循环运动。胞内若无阴离子时,所有的Prestin蛋白都位于“缩短”的状态,OHC则收缩到最小。实验证实,水杨酸盐是Prestin蛋白阴离子结合位点的竞争性拮抗剂,亲和力比C1大约300倍,因此服用大量阿斯匹林使OHC电能动性减小是导致听力损失的可能原因之一。以往研究认为,AmAn的耳毒性作用机制之一是由于AmAn作用于外毛细胞,引起外毛细胞纤毛散乱、缺失,外毛细胞凋亡或坏死性死亡,导致听觉功能的损害。在此我们假设,AmAn的耳毒性对外毛细胞的作用过程中,可能是直接对外毛细胞基底部外侧膜上表达的Prestin蛋白产生了作用,影响了Prestin蛋白的表达抑或是直接影响了Prestin蛋白的功能,AmAn对Prestin蛋白的直接作用可能先于对外毛细胞的损害,这对于我们认识和理解AmAn的耳毒性机制是一个新的启发。目的建立卡那霉素致小鼠耳毒性模型；明确小鼠耳毒性模型中,卡那霉素对耳蜗外毛细胞基底部外侧膜上表达的马达蛋白Prestin直接作用及其特点；探讨小鼠耳毒性模型中,卡那霉素耳毒性作用引起耳蜗内组织细胞的凋亡、凋亡信号转导途径及其发生特点；探讨卡那霉素所致的耳蜗内细胞凋亡与Prestin蛋白表达及功能之间的关联；建立转染Prestin基因的细胞株CHO-K1,在体外情况下,研究卡那霉素及细胞外的氯离子浓度对转染Prestin细胞的膜电位及细胞内的氯离子浓度的影响,从而进一步评估这些因素对Prestin功能的影响。方法1、建立卡那霉素诱导产生的BALB/c小鼠耳毒性模型。2、听觉脑干反应(ABR)的检测：采用tone-pip声刺激,检测小鼠耳毒性模型在不同刺激声频率上的听觉阈值的变化,用以客观评估卡那霉素给药组与对照组的小鼠的听觉功能变化及其二者间的差异；3、免疫组织化学：应用耳蜗石蜡切片与免疫组织化学方法,探讨耳毒性引起的耳蜗外毛细胞的损害与对Prestin蛋白的影响二者间的关联；耳蜗基底膜硬铺片、原位免疫荧光染色、激光共聚焦显微成像技术相结合,以观察耳蜗外毛细胞马达蛋白Prestin的表达与耳毒性之间的相关性；采用耳蜗石蜡切片、TUNEL与免疫组织化学方法,研究卡那霉素耳毒性过程中,耳蜗内组织细胞的凋亡、凋亡信号转导途径及凋亡发生的特点。4、Real-time PCR检测：在卡那霉素不同用药时间组的小鼠耳蜗内,检测Prestin蛋白的RNA表达量,以观察卡那霉素在分子水平上对Prestin蛋白的作用；检测不同用药时间组的小鼠耳蜗内miR-34a, miR-34c的表达,研究二者是否参与了AmAn的耳毒性所导致的耳蜗内组织细胞凋亡的调控过程。5、转染Prestin-pcDNA3.1(-)的质粒到细胞株CHO-K1,通过药物筛选建立体外高表达Prestin蛋白的细胞株,并采用荧光探针染料标记结合显微荧光成像记录技术,研究卡那霉素及细胞外的氯离子浓度对高表达Prestin蛋白的细胞膜电位与细胞内的氯离子浓度的影响。通过卡那霉素体外诱导转染细胞的凋亡,观察Prestin蛋白与细胞凋亡之间的关系。结果1、成功建立卡那霉素致BALB/c小鼠耳毒性模型。2、在卡那霉素所致的小鼠耳毒性过程中,用药组小鼠的各刺激声频率上的ABR阈值上移,与用药时间呈正相关性,而对照组的ABR听觉阈值则没有明显变化；用药10天后,用药组与对照组间ABR听觉阈值存在极显著性差异；高频率(≥24kHz)的ABR听觉阈值较早(用药7天后)发生改变,而低频率(≤8kHz)的ABR听觉阈值改变则相对较晚。3、耳蜗外毛细胞的损害程度与用药时间之间具有正相关性；外毛细胞马达蛋白Prestin的表达量及表达位置发生变化；Prestin蛋白的RNA表达量也受到卡那霉素耳毒性的影响,表达量减少,与用药时间之间存在着负相关性。4、各用药组的耳蜗石蜡切片TUNEL检测,显示耳蜗内组织细胞出现凋亡现象,且与用药时间呈一定的正相关性。5、免疫组织化学检测凋亡信号途径,以Calpain介导的细胞凋亡信号最为明显,Calpain蛋白的表达与用药时间呈一定的正相关性。6、Real-time PCR检测参与细胞凋亡调控的miR-34a在耳蜗内表达量与用药剂量呈正相关性；而另一参与细胞凋亡调控的小分子RNA—miR-34c的表达在用药组与对照组之间比较无显著性差异。7、卡那霉素作用于转染后高表达Prestin蛋白的CHO-K1细胞,能够使细胞内的氯离子浓度升高,细胞膜电位去极化；去除细胞外溶液的氯离子,也能够使细胞膜电位去极化,细胞内的氯离子浓度轻微升高；Prestin转染组和对照组之间比较,卡那霉素与去除细胞外的氯离子对细胞膜电位的影响无显著差异性,去除细胞外的氯离子对于细胞内的氯离子浓度的改变也无差异性,但卡那霉素升高细胞内的氯离子浓度却在两组之间存在着极显著性差异。8、卡那霉素作用于转染细胞,可引起细胞的凋亡,与用药时间呈正相关性；转染Prestin的细胞的凋亡率明显高于对照组。讨论我们的研究表明,在卡那霉素所致小鼠耳毒性模型中,模型小鼠的听觉ABR阈值上移,高频率阈值改变早于低频率阈值改变,这是由于卡那霉素的耳蜗毒性损害是先从耳蜗基底部开始,并向耳蜗顶部发展,而耳蜗基底部主要是对高频声敏感,耳蜗顶部则是对低频声敏感,因此卡那霉素耳毒性损害先影响高频段听觉,后作用于低频段听觉。实验结果显示,在卡那霉素的耳毒性过程中,外毛细胞及其它一些内耳组织细胞发生了凋亡性死亡,Calpain信号转导途径是其中一个重要的凋亡途径,这可能是由于卡那霉素的耳毒性作用使得细胞内的钙离子浓度升高,致Calpain蛋白过度激活,引起细胞骨架和细胞膜的崩溃,膜蛋白,各种激酶,磷酸酶以及转录因子都受到严重影响,最终导致细胞凋亡。MiRNA(microRNA)是一类小分子RNA,它的生成机制目前还不是很清楚,对真核生物如基因表达、细胞周期调控和个体发育等许多功能产生影响。它可以作为触发RNA干扰的分子参与细胞增殖、死亡、凋亡和脂肪代谢,它还可能与转座的抑制、基因重组有关,可能参与了转录和转录后水平的基因表达调控。有研究认为,miR-34a,miR-34c参与细胞凋亡的调控,也与年龄相关的耳聋有关联。在本研究中发现,卡那霉素所致小鼠耳毒性过程中,miR-34a确实参与了耳蜗内细胞凋亡的调控,其表达量也与用药呈正相关性,这可能是由于卡那霉素的耳毒性引起耳蜗内组织细胞内的miR-34a表达上调,而后者则进一步调控细胞周期,抑制增殖,促进凋亡；miR-34c没有参与卡那霉素导致的耳蜗内细胞凋亡的调控。虽然miR-34a参与了卡那霉素致小鼠耳毒性过程中,耳蜗内细胞凋亡的调控,但它是如何产生,又是如何参与调控还是未知,有待于更深入的研究阐述。在外毛细胞凋亡过程中,位于其基底部外侧膜上马达蛋白Prestin,也受到AmAn的耳毒性作用的影响,Prestin蛋白表达量减小；形态学研究显示,Prestin蛋白表达位置也发生改变,它从外毛细胞上“脱落”下来,聚集在外毛细胞凋亡缺失后留下的“瘢痕”处形成“斑块样”结构,有些可能进入到附近的支持细胞内,这些蛋白质的最终命运如何,这还需要进一步的研究来阐述。分子生物学实验结果表明,卡那霉素所致耳毒性过程中,先于外毛细胞损害缺失(用药14后)之前,卡那霉素已经引起Prestin蛋白的RNA表达量的减少(用药7天后),且与用药时间呈负相关性,这种改变也发生在Prestin蛋白表达的形态学异常情况出现(用药14天后)之前,提示卡那霉素可能从分子水平上直接影响Prestin蛋白表达的调控,从而影响Prestin蛋白的功能。研究已经表明,细胞内的氯离子浓度对于Prestin蛋白功能具有重要影响,细胞内的氯离子可以作为Prestin蛋白的“电压感受器”,感受细胞膜电位变化,促进Prestin蛋白的构象改变。将细胞内的氯离子完全去除后,Prestin蛋白的功能则全部丧失,由此可知,细胞内的氯离子浓度的变化对于Prestin蛋白功能具有直接的影响。细胞膜电位的变化也对Prestin蛋白的功能至关重要。当细胞膜电位去极化时Prestin蛋白“收缩”,导致细胞“缩短”；反之当细胞膜电位超极化时,Prestin蛋白“伸长”,细胞则伸长。因此通过观察卡那霉素作用于高表达Prestin蛋白的细胞,细胞膜电位以及细胞内的氯离子浓度的变化,以此间接地评估对Prestin蛋白功能的影响。除了研究卡那霉素对细胞的直接作用外,还通过改变细胞外的氯离子浓度,观察对转染细胞的细胞膜电位及细胞内的氯离子浓度影响。实验结果显示,卡那霉素可以直接影响细胞膜电位,使细胞膜电位去极化,但作用在Prestin转染组与对照组细胞之间没有明显差别,表明卡那霉素对细胞膜电位的影响是非特异性的。这种作用可能是由于卡那霉素与细胞膜上的磷酸肌醇相结合后,导致细胞内的钙离子浓度升高,细胞去极化。在体情况下,进入耳蜗外毛细胞周围的卡那霉素仍可能通过使外毛细胞膜去极化而间接影响Prestin蛋白的功能,进而影响耳蜗的听觉功能。卡那霉素能够使高表达Prestin的CHO-K1细胞内的氯离子浓度较对照组有显著性升高,这可能是由于卡那霉素直接地竞争性抑制作用使得转染组细胞膜上表达的Prestin蛋白原本结合的氯离子“解离”下来释放到细胞内,也可能是由于卡那霉素使细胞膜去极化,膜上表达的Prestin蛋白“缩短”,氯离子从Prestin蛋白上的结合位点“解离”后释放到细胞内,间接作用使转染组细胞比对照组细胞内的氯离子浓度的变化大。卡那霉素影响细胞膜电位以及细胞内的氯离子的浓度变化的作用很快(几分钟至几十分钟),细胞膜电位的改变以及细胞内的氯离子浓度的改变都是快速、可逆的,这也许可以解释在临床治疗过程中的AmAn急性耳毒性作用,当在应用AmAn的早期发生耳毒性作用时,如能够及时停止用药,这种急性耳毒性作用会逐渐消失,听觉功能会恢复。因此我们认为,AmAn的急性耳毒性作用很可能是由于它们引起外毛细胞的膜电位及细胞内的氯离子浓度改变,直接或间接地导致外毛细胞膜上的Prestin蛋白的功能受到了影响,而这种急性耳毒性作用是快速、可逆的,随着停药后耳蜗内的AmAn逐渐清除,外毛细胞恢复正常状态和功能,受损的听觉功能逐渐恢复。至于长期应用AmAn所引起的耳毒性作用,则是由于激活了其它的损伤应激机制,如细胞的凋亡,外毛细胞凋亡坏死,缺失,Prestin蛋白表达位置发生改变,表达量减少,功能受到严重影响,由此导致的听觉功能是不可逆性的损害。综上所述,在AmAn耳毒性作用过程中,最初在外毛细胞的损害出现之前,AmAn可能直接作用于Prestin蛋白,影响其功能,也可能通过作用于Prestin蛋白的RNA合成阶段,从而影响调控Prestin蛋白的表达及功能,最终导致听觉功能的下降,产生AmAn的急性耳毒性作用,这个过程是快速的,可逆的,如能够及时去除AmAn的作用,听觉功能会逐渐恢复；如果不能及时停止AmAn耳毒性作用,将导致外毛细胞凋亡、缺失,Prestin蛋白表达量严重减少,表达位置也发生改变,由此导致听觉功能的永久性损害。这对于我们临床预防和治疗AmAn的耳毒性具有重要的参考价值。在临床长期应用AmAn药物时,应及时监测患者的听觉功能,并应注意对早期耳毒性先引起高频听觉(12kHz至16kHz)损害进行检测,发现听觉功能早期损害时,应及时调整用药,或是停药一段时间,待听觉功能恢复后再继续治疗。结论1、在动物模型中,长期大剂量应用卡那霉素可以引起慢性耳毒性作用,听觉功能损害随着用药时间的延长而加重,听觉阈值升高,高频听觉功能较早受损。2、卡那霉素致小鼠耳毒性过程中,引起耳蜗内细胞凋亡性死亡,且与用药时间具有正相关性。3、在耳蜗内细胞凋亡过程中,以Calpain(钙调蛋白)信号转导途径为主,Calpain蛋白表达上调,且与用药时间具有一定的正相关性。4、miR-34a参与了卡那霉素所致耳蜗内细胞凋亡的调控,其表达量与用药时间及细胞凋亡的严重程度呈正相关性。5、卡那霉素慢性耳毒性过程中,导致外毛细胞崩溃、死亡、缺失,引起Prestin蛋白的表达量减少,与用药时间呈正相关性,Prestin蛋白的表达位置也发生改变；卡那霉素也可以直接地影响Prestin蛋白的RNA合成,随着用药时间的延长,耳蜗Prestin蛋白的RNA含量逐渐减少,其改变明显先于外毛细胞及prestin蛋白表达的形态学变化。6、在体外建立高表达Prestin蛋白的CHO-K1细胞株,研究显示,卡那霉素与细胞外的氯离子浓度的改变都可以非特异性地影响细胞的膜电位,使细胞去极化；卡那霉素可以显著性地升高转染表达Prestin蛋白的细胞内的氯离子浓度。细胞膜去极化及细胞内的氯离子浓度的改变都会进一步影响到膜上表达的Prestin蛋白的功能。7、卡那霉素可以引起细胞的凋亡,转染Prestin的细胞较对照组凋亡率显著性升高,且与用药时间呈正相关性。