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癫痫是一种危及人类健康的常见疾病。癫痫发作是大脑神经元突发性异常放电,导致的一种短暂的大脑功能障碍(Chang& Lowenstein,2003)。癫痫的特点是短暂性、反复性和相对刻板性。目前我国约有800万左右癫痫患者,且每年有40万新发病人。癫痫发作不仅使患者痛苦,降低其生活质量,对其家人的生活也造成很大影响。
目前对于癫痫发病的机制尚无明确的定论,研究证明,NMDA受体的过度激活在癫痫病的产生过程中起重要的作用,癫痫发作时,神经元兴奋性增强引起兴奋性谷氨酸递质释放增加,细胞外谷氨酸浓度增高。大量的谷氨酸过度激活神经元膜上的NMDA受体,引起Ca2+内流,导致细胞内信号过度激活和神经元兴奋性异常增高,最终结果是神经元死亡和大脑神经元环路异常激活所致的癫痫的产生。
干贝素又称琥珀酸钠(sodium succinate,SS),是广泛存在于海洋生物中的有机盐。琥珀酸是中药琥珀的主要活性成分,具有镇痛、镇静、抗惊厥等多种药理效果。琥珀酸是三羧酸循环的中间代谢物,其化学结构与牛磺酸、兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性氨基酸神经递γ-GABA相似,提示琥珀酸可能是一种脑内天然抗癫痫的内源性神经调质(modulator),加之琥珀酸具有毒性小、来源广、价格低廉等优点,所以需要我们进一步研究探讨并最终将其临床推广。目前已有报道称干贝素可降低脑内谷氨酸水平,但其抑制作用是否与NR2A受体有直接关系并无报导,我们将在本实验中进一步证实。
目的:我们利用戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)制造癫痫大鼠模型,以不同剂量的干贝素及NMDAR2A受体选择性抑制剂NVP-AAM077进行干预,检测海马CA1区NR2A受体的表达情况,进一步探讨干贝素发挥中枢抑制作用是否是直接通过影响NR2A而形成的。
方法:
1分组
采用完全随机设计。将70只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机抽取8只作为正常组(normal),其余62只用戊四氮制造癫痫模型,筛选造模合格大鼠40只进行随机分组:戊四氮致痫组(PTZ)和致痫后干贝素每次0.8g/kg干预组(PTZ+SS1+NS,MT1)、致痫后干贝素1.2g/kg干预组(PTZ+SS2+NS,MT2)、致痫后干贝素0.8g/kg、NVP-AAM077干预组(PTZ+SS1+NVP,MT3)、致痫后干贝素1.2g/kg、NVP-AAM077干预组(PTZ+SS2+MVP,MT4)。
2造模
正常组腹腔注射生理盐水,其余各组致痫大鼠按45mg/kg腹腔注射PTZ(1％浓度)溶液,每次注射间隔24小时,连续3天,直到大鼠完全点燃(出现RacineⅣ-Ⅴ级)。
3给药
MT3及MT4组侧脑室注射NVP-AAM0775μl,而MT1组、MT2组、PTZ组及正常组侧脑室注射生理盐水5μl。各侧脑室给药组给药速度均为1μl/分。
各干贝素干预组于癫痫终止后30分钟内灌胃,MT1、MT3组给予干贝素0.8g/kg/d,连续3天;T2、MT4组给予干贝素1.2g/kg/d,连续3天;PTZ组和正常组给予生理盐水灌胃,连续3天。
4脑电图
将大鼠麻醉后固定于固定架上,采用头皮针状电极单极导联法,于大鼠左右颞处留置针灸针,待大鼠清醒后制作急性癫痫模型,观察痫性放电的频率及其振幅变化。
5免疫组织化学染色
麻醉状态下经左心室行主动脉插管,4％多聚甲醛溶液进行灌注,取脑固定,常规包埋,标本冠状位石蜡切片。经过抗原修复、山羊血清封闭后,加NR2A抗体,再经二抗、三抗孵育,DAB显色后置显微镜下观察记录。
结果:
1癫痫行为学
腹腔注射PTZ后,造模大鼠均出现不同程度的痫性发作,造模成功。分别灌胃给予干贝素0.8g/kg.d、1.2g/kg.d次后,均可降低大鼠发作级别或延缓发作时间。
2脑电图学
正常对照组大鼠脑电图无异常,致痫大鼠脑电图出现高幅多棘波。
3 NR2A选择性抑制剂NVP-AAM077抗惊厥试验
应用NR2A选择性抑制剂NVP-AAM077后,不影响癫痫大鼠脑电图,也不影响大鼠达到各癫痫级别的时间。即本实验所用的NR2A选择性抑制剂NVP-AAM077的计量没有抗惊厥作用。
4免疫组化法检测海马CA1区NMDANR2A光密度值结果
戊四氮模型(PTZ)组与其它各组比较,NR2A密度最高都具有显著性差异(P＜0.05)。干贝素干预组与干贝素、NVP-AAM077干预组之间NR2A密度强弱有显著性差异(P＜0.05),光镜下观察,免疫组织化学染色后,空白对照组NR2A阳性细胞在大脑皮质各层内弥散分布。戊四氮模型(PTZ)组与其它各组相比,大脑皮层及海马NR2A免疫反应染色明显加深。
结论:
1干贝素能降低戊四氮致痫大鼠海马区神经元NR2A的表达。
2干贝素可降低PTZ致痫大鼠的发作级别或延缓发作时间,其可能的作用机制是经NR2A途径发挥中枢抑制作用。