水稻瘤矮病毒3个基因组分的克隆及原核表达

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水稻瘤矮病由水稻瘤矮病毒(RiceGallDwarfVirus,RGDV)引起,在我国主要分布于广东、广西局部地区。根据报道的RGDV泰国分离物组分9、10、11的核苷酸序列设计引物,以病株叶片总RNA为模板进行RT-PCR,获得了广东分离物S9、S10和S11的全序列。测序结果表明,德庆RGDVS9全长序列为1202nt,包含一个长972nt的开放阅读框,从26nt至997nt,编码323个氨基酸的蛋白,相对分子量为35.6kDa。从化RGDVSlO全长1198nt,包含一963nt的开放阅读框,从22nt至984nt,编码320个氨基酸的蛋白,相对分子量为36kDa。而德庆RGDVS¨全长l168nt,包含一1068nt的开放阅读框,由30nt延伸至1097nt,编码355个氨基酸的蛋白,相对分子量为40kDa。这三个蛋白均为RGDV的非结构蛋白。 对RGDV各分离物进行同源性比较发现,德庆分离物S9与泰国、信宜分离物相应片段全序列的同源率分别为98.3%和99.4%,从化与泰国、信宜分离物S10的全序列也显著同源,同源率分别为96.2%和99.1%,德庆与泰国、信宜RGDVS11的全序列也具有很高的同源性,分别为94.3%和99.1%;在编码区上,德庆与泰国、信宜分离物S9的同源率分别为98.4%和99.6%,从化与泰国、信宜分离物SlO的同源率为95.7%和98.8%,德庆与泰国、信宜分离物S¨的同源率分别为93.9%和99.0%。 对3个组分推导出的氨基酸序列进行分析比较,德庆与泰国、信宜分离物S9编码多肽同源率分别为98.5%和97.8%,从化与泰国、信宜分离物SlO编码多肽同源率分别为98.8%和99.7%,德庆与泰国、信宜分离物S¨编码多肽同源率分别为96.6%和98.9%。对多肽的物理性质进行比较,三个分离物主要在等电点方面具有一定差异,其它方面基本一致。对S9编码多肽基元序列进行分析发现,泰国分离物比其他两个分离物多1个N糖基化位点,三个分离物在SlO和S¨编码多肽上的基元序列完全一致。 通过上述的比较发现,本研究中获得的S9、S10、S¨三个组分与泰国、信宜分离物相应片段存在很高的相似性,且地域较近的广东各分离物之间的差异小于广东分离物与泰国分离物的差异。由于目前我们只分析比较了部分组分,其余组分及其编码多肽未进行分析比较,使得我们不能全面把握其分子特征,还没有充足的证据说明各分离物存在株系差异。 本研究首次将S9、S10和S11基因分别克隆至pET-28b(+)和pBV221原核表达载体上,并在大肠杆菌中高效表达,获得以包涵体形式存在的(融合或非融合)目的蛋白;S10原核表达产物通过Ni2+亲和层析柱纯化,得到电泳纯级制品。这为今后制备特异性抗血清,进而为进一步研究病毒基因的表达和功能及其表达产物的相互关系奠定了基础。
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