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研究背景结直肠癌是人类消化系统高发的恶性肿瘤之一,肠癌肝转移是结直肠癌的首要死亡原因。研究结直肠癌转移的机制,对于肿瘤的治疗有极大的帮助。其中肿瘤的发生、发展和转移不仅是因为肿瘤细胞本身的基因突变所致,还与肿瘤周围或远处的肿瘤微环境息息相关。为了探索影响肠癌发生发展的关键蛋白,本团队在早期研究中结合同位素标记定量质谱技术和基因微阵列技术发现相比于正常组织和早期肿瘤组织,Ras相关蛋白31(Ras-related protein 31,RAB31)蛋白在Ⅳ期肠癌组织中显著升高。RAB31属于高度保守的小GTP酶,是Ras超家族中最大的亚家族RAB家族中的一员,在细胞的胞吞胞吐、囊泡运输和膜结构的转化等生理过程中发挥重要作用。然而RAB31在结直肠肿瘤中的具体功能至今尚不明确。本研究旨在研究RAB31在结直肠肿瘤发生和发展中的作用,并尝试阐明其作用机制。研究内容和方法对98例结直肠癌病人的组织芯片进行分析,探究肠癌组织中RAB31表达与病人的预后关系;利用免疫组化染色和免疫荧光染色共定位RAB31在肿瘤组织中的表达位置。将RAB31-GFP融合蛋白质粒瞬转至原代结直肠的肿瘤相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblast,CAF)中,使用细胞免疫荧光染色确定RAB31的亚细胞定位;使用CCK8增殖实验、Transwell细胞迁移实验、经脾肝转移动物模型验证CAF-RAB31对肠癌细胞增殖、迁移能力和肝转移能力的的影响。利用Transwell细胞迁移实验筛选CAF-RAB31分泌上调的促肿瘤迁移因子,通过ELISA等实验检测肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)在CAF-RAB31中分泌情况,使用磷酸化酶抑制剂抑制MET磷酸化或shRNA敲降MET的方法来抑制RKO中的HGF-MET信号通路,验证在CAF中RAB31调控HGF分泌,通过激活肠癌中HGF/MET信号通路促进肠癌迁移。研究结果1.RAB31在肿瘤组织中高表达,RAB31在肿瘤细胞中的表达情况与预后不相关,而肿瘤间质中的RAB31高表达与不良预后相关(HR:1.85,p=0.02),在肿瘤间质,RAB31表达于CAF中,RAB31在CAF中部分定位于高尔基体,部分以点簇状形态表达于胞浆特定的囊泡上。2.成功培养、构建出过表达RAB31的人原代结直肠肿瘤相关成纤维细胞。3.CAF-RAB31的条件培养基(Conditional Medium,CM)对肠癌细胞的增殖无影响,但对肠癌细胞的迁移有明显促进作用(p=0.0067)。CAF-RAB31和RKO非接触性共培养显示出更快的划痕愈合速度(p=0.012),同时CAF-RAB31和RKO细胞混合注射能够增加其肝转移能力。4.CAF-RAB31较野生型CAF向胞外分泌更多的HGF,通过阻断肠癌细胞中的HGF-MET信号通路,CAF条件培养基的促迁移作用明显被减弱(p<0.05)。研究结论肠癌间质中RAB31高表达与患者不良预后相关;在肠癌间质中,RAB31表达于CAF,并且定位在CAF的高尔基体和特定的囊泡上。人原代肠癌CAF过表达Rab31能促进其向胞外分泌HGF,进而促进肠癌细胞迁移和远处转移。