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纤维素是一类重要而又较难利用的可再生性生物质资源,其酶促水解具有污染少、条件温和等优点,但是目前这种酶促水解过程存在速度慢、效率低等瓶颈问题,从而使得发现具有高稳定性、高活性的纤维素酶成为解决上述问题的重要方法之一。在纤维素的酶促水解过程中,纤维素酶系中的三种主要酶类(包括葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶以及β-葡萄糖苷酶)之间的相互协同作用,可将长链纤维素转变为易于利用的葡萄糖,其中以葡聚糖内切酶的作用最为关键。
葡聚糖内切酶广泛存在于细菌、真菌以及植物中,而细菌来源的葡聚糖内切酶具有基因数据明确、便于重组表达等优点,因此本课题采用虚拟筛选方法,从Swiss-prot数据库中选择了43个来自不同细菌菌株的预测的葡聚糖内切酶编码基因,其中22个基因成功地实现了在E.coli BL21/pET-43.1a系统中的异源表达,最终获得15个对羧甲基纤维素(CMC)有催化活力的重组葡聚糖内切酶。
首先选择了其中三个活力较高的内切酶EGtf1(Q08166)、EGtf2(Q7X2N2)和EGbs(B6DVJ2)进行了纯化和酶学性质的初步表征,测得酶EGtf1的比活力为1.149 u/mg prot、EGaf2的比活力为1.252 u/mg prot、EGbs的比活力为0.306 u/mg prot。三个酶的最适反应pH均为5左右,最适反应温度在50~60℃范围内。其中酶EGtf1及EGtf2有较好的热稳定性,在50℃的半衰期在1000 h以上。进一步的研究表明这两个酶在金属离子及有机溶剂存在时均能保持较好的活性,尤其在正十二醇存在时,酶EGtf1及EGtf2的比活力分别提高了2.1和2.7倍。由于这些特征,尤其是其较好的热稳定性,我们认为葡聚糖内切酶EGtf1和EGtf2值得进一步改造,具有潜在应用价值。