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目的:现如今,缺血性脑血管疾病因其高发病性、高危害性、低治疗性等特点已成为社会关注的焦点。多年来,大量学者为脑缺血-再灌注损伤的研究付出很多精力。但是,如何改变对缺血性损害抵抗力极低的脑神经元对缺血的耐受性,使其在经受缺血-再灌注损伤后仍具有正常的生理功能,一直仍是这类疾病研究上的难题。在两侧股动脉进行反复3次短暂夹闭和再灌注的缺血预处理的研究中,我们发现脑缺血-再灌注导致的大鼠海马CA1区锥体神经元细胞的延迟性死亡和凋亡可被肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning,LIP）通过上调p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）和extracellular signal-regulated kinases（ERK）的表达明显减弱,脑缺血的耐受能力也因此提高,从而证实了LIP对脑的保护作用。但是,缺血预处理的肢体与缺血损伤的大脑之间相距甚远,这种内源性保护性信号是如何被LIP启动、作用于脑,并使海马CA1区p38 MAPK和ERK的表达上调,此中的机制尚不完全明确。我们在进一步的研究中发现,LIP前切断两侧股神经和/或坐骨神经可部分消除LIP对脑缺血的保护效应,并逆转LIP对p38MAPK和ERK的上调作用;此外,国外学者Bolte、Malhotra等在研究中也发现缺血预处理是通过某种神经通路的激活发挥了对远隔器官的保护效应。这些实验结果均提示,远隔器官缺血预处理的保护作用有神经途径的参与。此外,研究者也证实了缺血耐受中体液途径的作用,例如:LIP的脊髓保护作用可因静脉内提前实施自由基清除剂二甲基硫脲（N,N’-dimethylthiourea,DMTU）而逆转;Montero等报道,缺血再灌注引起的心肌损伤可因静脉注射腺苷而减轻;Kingma等发现运用自主神经节阻断剂六烃季铵及手术切除心外神经并不会消除肾动脉缺血预处理对心肌的保护作用。Lim等在鼠心肌缺血模型实验中,发现阻断股静脉或同时切断股神经和坐骨神经后均可消除肢体缺血预处理对心肌的保护作用,而分别切断股神经和坐骨神经只是部分消除了其保护作用,表明肢体缺血预处理对心肌的保护作用有神经-体液机制的参与。我们近期的研究也证实,分别或联合切断大鼠股神经和坐骨神经均能不同程度地消除LIP的脑保护作用,并下调海马CA1区p38 MAPK和ERK的表达;大鼠股静脉提前应用自由基清除剂DMTU或腺苷A1受体拮抗剂环戊基二丙基黄嘌呤（1,3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine,DPCPX）均能不同程度地抑制LIP的脑保护作用,并下调海马CA1区p38 MAPK和ERK的表达;而LIP的脑保护作用和海马CA1区p38 MAPK和ERK的上调可通过股静脉提前应用腺苷（adenosine,Ade）模拟。这些研究结果分别从神经、体液途径两个方面探讨了LIP脑保护作用的机制。那么LIP是否也能通过神经-体液联合机制产生脑保护作用、并影响p38 MAPK和ERK的表达呢?基于此,本课题的研究目的在于:探讨股神经、坐骨神经、自由基、腺苷在LIP脑保护作用及上调海马CA1区p38 MAPK和ERK表达中的协同作用,以观察神经-体液通路在LIP脑保护中的作用,从而进一步明确肢体缺血预处理发挥脑保护作用及上调p38 MAPK和ERK的机制,为提高神经元缺血耐受性提供更充实有力的依据,为预防与治疗缺血性脑血管病开辟更广阔的天地。方法:选用健康雄性Wistar大鼠（250300g）464只,随机分为2部分:（1）股神经、坐骨神经及自由基在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用;（2）股神经、坐骨神经及腺苷在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用。1股神经、坐骨神经及自由基在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用（1）sham组（n=16）:仅表露两侧颈总动脉,但不夹闭;（2）全脑缺血（brain ischemia,BI）组（n=16）:夹闭两侧颈总动脉8 min,随即恢复血液供应;（3）LIP+BI组（n=16）:夹闭两侧股动脉10 min、再灌注10 min、反复3次作为LIP,再即刻进行BI组操作;（4）股神经横断（femoral nerve transection,FNT）+LIP+BI组（n=16）:LIP前横断两侧股神经,LIP后即刻进行BI组操作;（5）坐骨神经横断（sciatic nerve transection,SNT）+LIP+BI组（n=16）:LIP前横断两侧坐骨神经,LIP后即刻进行BI组操作;（6）FNT+SNT+LIP+BI组（n=16）:LIP前联合横断两侧股神经及坐骨神经,LIP后即刻进行BI组操作;（7）DMTU+LIP+BI组（n=16）:股静脉内注射DMTU（500 mg/kg）,1 h后随即给予LIP,再即刻进行BI组操作;（8）DMTU+FNT+LIP+BI组（n=16）:股静脉内注射DMTU（500mg/kg）,1 h后横断两侧股神经,随即给予LIP,再随即即刻进行BI组操作;（9）DMTU+SNT+LIP+BI组（n=16）:股静脉内注射DMTU（500mg/kg）,1 h后横断两侧坐骨神经,随即给予LIP,再即刻进行BI组操作;（10）DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组（n=16）:股静脉内注射DMTU（500mg/kg）,1 h后联合横断两侧股神经及坐骨神经,随即给予LIP,再即刻进行BI组操作。2股神经、坐骨神经及腺苷在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用2.1股神经、坐骨神经及腺苷A1受体拮抗剂DPCPX在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用（1）6组步骤同1（1）6（n=16）;（7）DPCPX+LIP+BI组（n=16）:LIP前5 min股静脉内注射DPCPX（32 nmol/kg）后,LIP后即刻进行BI组操作;（8）DPCPX+FNT+LIP+BI组（n=16）:横断两侧股神经前5 min股静脉内注射DPCPX（32 nmol/kg）,横断两侧股神经后随即给予LIP,再即刻进行BI组操作;（9）DPCPX+SNT+LIP+BI组（n=16）:横断两侧坐骨神经前5 min股静脉内注射DPCPX（32 nmol/kg）,横断两侧坐骨神经后随即给予LIP,再即刻进行BI组操作;（10）DPCPX+FNT+SNT+LIP+BI组（n=16）:联合横断两侧股神经及坐骨神经前5 min股静脉内注射DPCPX（32 nmol/kg）,联合横断两侧股神经及坐骨神经后随即给予LIP,再即刻进行BI组操作。2.2股神经、坐骨神经及腺苷在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用（1）sham组（n=16）:仅表露两侧颈总动脉,但不夹闭;（2）BI组（n=16）:夹闭两侧颈总动脉8 min,随即恢复血液供应;（3）FNT+BI组（n=16）:横断两侧股神经,即刻进行BI组操作;（4）SNT+BI组（n=16）:横断两侧坐骨神经,即刻进行BI组操作;（5）FNT+SNT+BI组（n=16）联合横断两侧股神经及坐骨神经,再即刻进行BI组操作;（6）腺苷（Adenosine,Ade）+BI组（n=16）:夹闭两侧颈总动脉前10min股静脉内注射Ade（20nmol/kg）,10min后即刻进行BI组操作;（7）Ade+FNT+BI组（n=16）:横断两侧股神经前10min股静脉内注射Ade（20 nmol/kg）,横断两侧股神经后即刻进行BI组操作;（8）Ade+SNT+BI组（n=16）:横断两侧坐骨神经前10min股静脉内注射Ade（20 nmol/kg）,横断两侧坐骨神经后即刻进行BI组操作;（9）Ade+FNT+SNT+BI组（n=16）:联合横断两侧股神经及坐骨神经前10 min股静脉内注射Ade（20 nmol/kg）,联合横断两侧股神经及坐骨神经后即刻进行BI组操作。以上各组动物分别用于以下两方面的观察:（1）硫堇染色观察股神经、坐骨神经、自由基或腺苷在LIP诱导的大鼠脑缺血耐受中的协同作用:各组大鼠6只于脑缺血sham手术和末次全脑缺血后7 d断头取脑,常规方法制备组织切片后行硫菫染色。依据Kitagawa（1990）和Kato（1991）分级方法低倍显微镜下确定海马CA1区组织学分级（histological grade,HG）,具体标准如下:0级:无神经元死亡;I级:散在神经元死亡;II级:成片神经元死亡;III级:几乎全部神经元死亡。两侧海马CA1区锥体细胞数目采取高倍显微镜下每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的细胞数量计数,每张切片两侧海马各计数3个区段,计算其平均数作为神经元密度（neuronal density,ND）,依此判定迟发性神经元损伤程度。（2）应用免疫组织化学和Western blot方法测定大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK蛋白的表达:（1）免疫组织化学:各组大鼠分别取5只于sham手术和末次全脑缺血手术后12 h断头取脑,按常规方法制备组织切片,使用p-p38 MAPK或p-ERK抗体分别标记p-p38 MAPK或p-ERK,DAB显色后,阳性细胞显色面积及积分光密度应用形态学显微图像分析系统测定,以对p-p38 MAPK和p-ERK蛋白表达情况作相对定量分析;（2）Western blot:各组其余5只大鼠于末次手术后12 h断头取脑,留取海马CA1区脑组织,按Western blot标准方法对p38 MAPK和ERK蛋白进行相对定量分析。结果:1股神经、坐骨神经及自由基在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用1.1硫菫染色结果显示,sham组大鼠海马CA1区锥体神经元细胞整齐、致密的排列,分成23层,细胞形态完整、边界清晰,未见细胞缺失,胞核饱满、核仁深染、清晰,未见明显的延迟性神经元死亡（delayed neuronal death,DND）,HG为0级,ND值为221.56±9.38（cells?mm,下同）。BI组大鼠海马CA1区组织学损伤显著,DND严重,细胞形态发生了明显改变,神经元几乎全部死亡或缺失,HG为III级,ND值为47.67±4.82,与sham组比较,HG明显加重（P<0.01）,ND值明显减少（P<0.01）。LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元损伤不明显,仅个别细胞呈现胞核固缩,细胞整齐排列,未见明显缺失,与BI组比较,HG（0I级）明显降低、ND值（210.44±9.85）明显升高（P<0.01）。大鼠海马CA1区锥体神经元在FNT+LIP+BI组、SNT+LIP+BI组、FNT+SNT+LIP+BI组、DMTU+LIP+BI组、DMTU+FNT+LIP+BI组、DMTU+SNT+LIP+BI组及DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组组织学损伤显著,DND严重,细胞形态发生了明显改变,神经元成片或几乎全部死亡或缺失,HG为ⅡⅢ级,ND值分别为140.33±7.45、138.67±3.29、100.78±7.09、120.33±3.86、107.43±4.43、106.58±5.64和69.87±5.55,与LIP+BI组比较,HG明显加重（P<0.01）,ND值明显减少（P<0.01）,以DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组变化最显著。而FNT+LIP+BI组与SNT+LIP+BI组、DMTU+FNT+LIP+BI组与DMTU+SNT+LIP+BI组两两间比较均无明显统计学差异（P>0.05）。上述结果表明,LIP可部分逆转大鼠全脑缺血-再灌注导致的海马CA1区神经元损伤、发挥脑保护作用;而横断两侧股神经和/或坐骨神经或股静脉注射自由基清除剂DMTU均可部分阻断LIP的上述保护作用,横断两侧股神经及坐骨神经联合股静脉注射DMTU阻断作用更加明显,提示LIP诱导的脑缺血耐受有神经和体液因子自由基的共同参与。1.2（1）免疫组化结果显示,大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK在sham组和BI组的表达较低,阳性细胞胞核着色浅,呈棕黄色,p-p38 MAPK的积分光密度分别为12.19±0.47和12.77±0.23,p-ERK的积分光密度分别为4.59±0.21和4.74±0.40,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为5358.01±32.45（μm2,下同）和5702.90±266.85,p-ERK的阳性细胞总面积分别为3441.77±359.49和3485.16±283.18。与BI组比较,大鼠海马CA1区神经元p-p38 MAPK和p-ERK的阳性表达在LIP+BI组显著增多,细胞胞核着色加深,呈深棕黄色,p-p38 MAPK的积分光密度为68.43±0.32,p-ERK的积分光密度为31.12±0.98,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积为19843.38±393.69,p-ERK的阳性细胞总面积为15043.07±224.01,积分光密度和阳性细胞总面积均明显升高,有显著统计学差异（P<0.01）。FNT+LIP+BI组、SNT+LIP+BI组、FNT+SNT+LIP+BI组、DMTU+LIP+BI组、DMTU+FNT+LIP+BI组、DMTU+SNT+LIP+BI组和DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组海马CA1区神经元中p-p38 MAPK和p-ERK的表达量均较低,胞核染色较浅,p-p38 MAPK的积分光密度分别为33.61±0.82、33.02±0.62、26.84±0.84、37.38±0.67、28.47±0.38、28..42±0.45和19.70±0.59,p-ERK的积分光密度分别为12.94±0.46、12.89±0.34、10.74±0.36、13.32±0.41、10.72±0.40、10.68±0.46和8.16±0.35,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为9575.70±393.69、9585.04±268.08、7570.08±331.86、9577.59±244.29、7387.82±274.47、7391.85±354.45和5590.46±216.62,p-ERK的阳性细胞总面积分别为6339.90±225.00、6330.74±157.03、4494.76±167.65、6579.09±220.12、4404.48±316.31、4394.92±256.59和2587.94±217.21,与LIP+BI组比较,均有统计学差异（P<0.01）,以DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组尤为显著;（2）Western blot结果显示,海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK在全脑缺血的sham组和BI组的表达量均较低,p-p38 MAPK的IOD值与相应β-actin的IOD值的比值分别为0.33±0.02和0.34±0.03,p-ERK的IOD值与相应β-actin的IOD值的比值分别为0.35±0.04和0.33±0.03。与BI组比较,p-p38MAPK和p-ERK在LIP+BI组的的表达量明显增多,p-p38MAPK和p-ERK的IOD值与相应β-actin的IOD值的比值（分别为0.87±0.02和0.83±0.02）明显升高,均有统计学差异（P<0.01）。FNT+LIP+BI组、SNT+LIP+BI组、FNT+SNT+LIP+BI组、DMTU+LIP+BI组、DMTU+FNT+LIP+BI组、DMTU+SNT+LIP+BI组和DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组中p-p38MAPK和p-ERK的表达量均较少,与LIP+BI组比较,均有统计学差异（P<0.01）,以DMTU+FNT+SNT+LIP+BI组最显著。以上免疫组化、Western blot结果显示,LIP上调脑缺血大鼠海马CA1区p-p38MAPK和p-ERK的表达、发挥脑保护作用有股神经、坐骨神经及体液因子自由基的共同参与。2股神经、坐骨神经及腺苷在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用2.1股神经、坐骨神经及腺苷A1受体拮抗剂在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用2.1.1硫菫染色结果显示,sham组、BI组、LIP+BI组、FNT+LIP+BI组、SNT+LIP+BI组及FNT+SNT+LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元组织学损伤及细胞形态改变同1.1。DPCPX+LIP+BI组、DPCPX+FNT+LIP+BI组、DPCPX+SNT+LIP+BI组及DPCPX+FNT+SNT+LIP+BI组海马CA1区锥体神经元组织学损伤明显,呈现严重的DND,与LIP+BI组比较HG（ⅡⅢ级）明显升高（P<0.01）,ND值（分别为140.78±5.71、102.22±11.25、81.22±6.48、79.44±5.31和58.33±2.4）显著降低（P<0.01）,尤以DPCPX+FNT+SNT+LIP+BI组的变化最明显。以上结果显示,大鼠脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元的损伤可被LIP明显减轻,分别或联合横断两侧股神经和坐骨神经或股静脉应用腺苷A1受体拮抗剂DPCPX均可部分阻断LIP的上述效应,而神经横断和股静脉注射同时应用时阻断作用明显增强,提示LIP诱导的脑缺血耐受有神经和体液因子腺苷共同参与。2.1.2（1）免疫组化结果显示,全脑缺血sham组、BI组、LIP+BI组、FNT+LIP+BI组、SNT+LIP+BI组及FNT+SNT+LIP+BI组海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK表达趋势同1.2（1）。与LIP+BI组比较,大鼠海马CA1区锥体神经元中p-p38 MAPK和p-ERK在DPCPX+LIP+BI组、DPCPX+FNT+LIP+BI组、DPCPX+SNT+LIP+BI组和DPCPX+FNT+SNT+LIP+BI组的表达量明显减低,细胞胞核染色较浅,p-p38 MAPK的积分光密度分别为30.35±0.86、23.70±0.59、23.41±0.74和15.32±0.39,p-ERK的积分光密度分别为16.40±0.49、11.12±0.18、11.19±0.29、和9.45±0.30,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为9765.96±347.28、6668.90±354.16、6703.29±376.45和3528.92±395.46,p-ERK的阳性细胞总面积分别为4498.82±263.88、3165.54±233.04、3138.54±93.17和2161.92±120.90,均有统计学差异（P<0.01）,以DPCPX+FNT+SNT+LIP+BI组最显著。（2）Western blot结果中p-p38 MAPK和p-ERK在各组中表达趋势均与免疫组化结果相符。以上免疫组化、Western blot结果表明LIP通过神经途径和体液因子腺苷上调了脑缺血海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK表达。2.2股神经、坐骨神经及腺苷在LIP诱导的脑缺血耐受中的协同作用2.2.1硫菫染色结果显示,大鼠海马CA1区锥体细胞在sham组的HG为0级,DND不明显,ND值为218.67±9.22。大鼠海马CA1区锥体细胞在BI组表现出明显的组织学损伤,严重的DND,HG为III级,ND值为48.89±8.11,与sham组比较,HG明显加重（P<0.01）,ND值明显减少（P<0.01）。与BI组比较,大鼠海马CA1区神经元在FNT+BI组、SNT+BI组和FNT+SNT+BI组,HG为III级,ND值分别为47.56±5.98、46.78±6.55和45.44±6.81,无统计学差异（P>0.05）。Ade+BI组大鼠海马CA1区锥体细胞损伤明显减轻,仅个别细胞显现胞核固缩,神经元细胞整齐、致密的排列,细胞未见缺失,HG为0I级、ND值为184.33±8.66,与BI组比较,HG明显降低（P<0.01）,ND值明显升高（P<0.01）,有显著统计学差异。Ade+FNT+BI组、Ade+SNT+BI组和Ade+FNT+SNT+BI组海马CA1区可见明显的组织学损伤,锥体细胞形态发生改变,神经元表现为散在或接近成片死亡或缺失,HG为ⅠⅡ级、ND值分别为141.44±3.8、140.33±7.6和120.67±4.84,与Ade+BI组比较,HG明显加重（P<0.01）,ND值明显减少（P<0.01）,以Ade+FNT+SNT+BI组最明显。上述结果表明,大鼠脑缺血-再灌注导致的海马CA1区组织学损伤被腺苷明显减轻,而分别或联合横断两侧股神经和坐骨神经仅可部分消除上述作用,进一步表明LIP通过神经途径和体液因子腺苷诱导了脑缺血耐受。2.2.2（1）免疫组化结果显示,sham组、BI组、FNT+BI组、SNT+BI组和FNT+SNT+BI组可见海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK阳性表达较少,细胞胞核着色较浅,呈棕黄色,p-p38 MAPK的积分光密度分别为12.19±0.47、12.77±0.23、12.15±0.43、12.17±0.56和12.11±0.12,p-ERK的积分光密度分别为4.59±0.21、4.74±0.40、4.68±0.16、4.69±0.22和4.62±0.17,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为5358.01±32.45、5702.90±266.85、5691.00±319.26、5690.01±380.50和5686.45±360.26,p-ERK的阳性细胞总面积分别为3441.77±359.49、3485.16±283.18、3477.66±214.14、3469.28±188.70和3466.88±252.03。与BI组比较,大鼠海马CA1区神经元p-p38 MAPK和p-ERK在Ade+BI组的阳性表达明显增加,胞核着色增深,呈深棕黄色,p-p38 MAPK的积分光密度为46.53±0.88,p-ERK的积分光密度为25.64±0.40,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积为13591.12±330.54,p-ERK的阳性细胞总面积为13290.42±215.10,有统计学意义（P<0.01）,以Ade+FNT+SNT+BI组最显著。上述结果表明Ade可使脑缺血大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK表达上调,产生类似LIP的脑保护效应。Ade+FNT+BI组、Ade+SNT+BI组和Ade+FNT+SNT+BI组p-p38 MAPK和p-ERK的表达显著减少,胞核染色明显变浅,p-p38 MAPK的积分光密度分别为35.16±0.87、35.10±0.93和24.86±0.85,p-ERK的积分光密度分别为18.18±0.36、18.21±0.64、和11.11±0.19,p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为9796.71±345.65、9782.16±364.33和6765.81±308.10,p-ERK的阳性细胞总面积分别为11363.59±303.25、11325.14±325.21和9332.30±182.30,与Ade+BI组比较有显著差异（P<0.01）,尤以Ade+FNT+SNT+BI组最明显;（2）Western blot结果中p-p38 MAPK和p-ERK在各组中表达趋势均与免疫组化结果相符。上述免疫组化、Western blot结果进一步表明神经途径和腺苷共同参与了LIP上调大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达。结论:（1）LIP前横断两侧股神经和/或坐骨神经和/或股静脉注射自由基清除剂DMTU或腺苷A1受体拮抗剂DPCPX均可部分阻断LIP的脑保护作用,股静脉注射腺苷可以发挥类似LIP的脑保护作用。提示LIP通过股神经、坐骨神经、体液因子自由基及腺苷联合诱导了脑缺血耐受。（2）LIP前横断两侧股神经和/或坐骨神经和/或股静脉注射自由基清除剂DMTU或腺苷A1受体拮抗剂DPCPX均可部分阻断LIP对p-p38MAPK和p-ERK表达的上调作用,而股静脉注射腺苷可上调脑缺血大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达,发挥类似LIP的脑保护作用。提示LIP可通过神经-体液机制影响脑缺血大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达。