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目的: 半胱氨酸脱硫酶IscS在野生型MC4100中表达时因含有辅因子磷酸吡哆醛而为黄色，但在双敲除菌iscA-sufA-中表达则为红色。IscS可以催化底物L-半胱氨酸脱硫形成L-丙氨酸和硫，并在催化过程中形成7种中间产物。iscA和sufA敲除后，细胞中的铁硫簇组装中断，导致IscS催化产生硫和L-丙氨酸的累积，引发酶促反应逆反应导致IscS的中间产物的累积。本实验通过在缺铁环境中表达蛋白并进行光谱学及酶活测定等方面的分析，对该红色物质进行鉴定并分析其形成原因。 方法: 1.铁硫簇组装障碍环境的模拟 (1)、蛋白的纯化表达和纯化 通过在普通LB培养基中加入铁螯合剂Bipyridine的方法，使细菌处于缺铁的生长环境中。E.coli MC4100(Nth-[4Fe-4S])和MC4100(SoxR-[2Fe-2S])分别在正常LB和缺铁LB中诱导表达。蛋白质经Ni柱亲和脱盐纯化。纯化后的蛋白用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描分析，并进行SDS-PAGE电泳分析。 (2)、蛋白铁、硫含量的测定 采用菲哕嗪法测定蛋白中的铁含量:在L-cysteine的作用下，蛋白样品中铁释放出来并与菲哕嗪(Ferrozine)结合形成Fe-Ferrozine络合物，在564nm处具有特征性吸收峰，其消光系数为27.9mM-1cm-1，利用公式CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9（单位:μM）求得铁含量。 采用DPD法测定蛋白中的硫含量:硫化物与FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作为显色剂，可在669nm处形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系数即可算得蛋白中的硫含量。由于硫的消光系数不稳定，以Nth（一种稳定的[4Fe-4S]）为阳性对照，并以Nth计算硫的消光系数。根据公式计算硫含量:CS=(OD669-OD800)*1000/S消光系数（单位:μM） S消光系数=(OD669-OD800)*1000/Nth CSNth CS=Nth CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9 2.有氧及厌氧条件下IscS蛋白的表达纯化及分析 将IscS/MC4100和IscS/ iscAsufA-分别在正常及缺铁LB中培养至OD达到0.6，加入诱导剂L-阿拉伯糖前向一组中通入氩气并保持无氧状态。分别在有氧和无氧状态下诱导表达蛋白，经Ni柱亲和层析纯化和G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描分析和SDS-PAGE电泳分析。 3.缺铁环境下突变型IscS蛋白的表达纯化及分析 (1)、蛋白的纯化表达和纯化 突变型IscS(K206A/MC4100,C328S/MC4100,K206AC328S/MC4100)分别在正常LB和缺铁LB中进行诱导表达并纯化。 (2)、蛋白的活性测定 将纯化的半胱氨酸脱硫酶IscS与L-cysteine、DTT在37℃条件下进行孵育，IscS可催化底物L-cysteine脱硫，在DTT存在的条件下形成H2S，H2S与FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作为显色剂，可在669nm处形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系数即可算得蛋白中的硫含量，硫含量的多少可以直接反映IscS活性的大小。 4.醌型物质在体内的累积及纯化 IscS/iscA-sufA-在有氧条件下正常LB培养基中培养至OD达到0.6，加入L-阿拉伯糖进行诱导，每1小时收集菌体一次，共收集4次。收集的菌体破碎后经Ni柱亲和层析纯化和G-25脱盐以获取目的蛋白。纯化后的蛋白进行全波长扫描分析和SDS-PAGE电泳分析。 5.醌型物质在体外的消除--IscS与氧化剂H2O2的反应 纯化后的IscS/MC4100和IscS/iscAsufA-蛋白分别与不同浓度的H2O2反应，4℃孵育30min后，离心并进行全波长扫描分析。 结果: 1.缺铁环境中Nth和SoxR铁硫簇组装发生障碍 纯化后的蛋白在23.56KDa和17.15KDa的位置各有目的条带产生;全波长扫描结果发现缺铁LB中诱导表达的Nth其铁硫簇的吸收峰(419nm)下降，SoxR的3个铁硫簇的吸收峰(414nm、448nm、548nm)也明显下降;铁、硫含量测定发现缺铁LB中纯化出的蛋白其铁、硫含量均发生来了明显下降，说明在缺铁LB中[4Fe-4S]和[2Fe-2S]的组装发生了障碍; 2.缺铁时在有氧及厌氧条件下都能在大肠杆菌细胞中形成红色IscS 分别在有氧和无氧及正常LB和缺铁LB中诱导表达IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白。纯化后的蛋白在46.5KDa位置有目的条带产生;全波长扫描结果发现在有氧且正常的LB培养基中，只有IscS/iscA-sufA-蛋白出现了红色和528nm的特异性吸收峰;在有氧并缺铁的LB培养基中，IscS/iscA-sufA-蛋白红色加深且528nm的特异性吸收峰增高，同时IscS/MC4100也出现了红色和528nm的特异性吸收峰;在厌氧且正常的LB培养基中，IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白均无红色和528nm的特异性吸收峰;在厌氧且缺铁的LB培养基中，IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白均出现红色和528nm的特异性吸收峰。 3.点突变K206A，C328S，K206A/C328S在缺铁及正常LB中均不能形成红色IscS 纯化后的蛋白在46.5KDa位置有目的条带产生;全波长扫描结果发现只有野生型IscS缺铁LB中诱导出红色蛋白并具有528nm的特征性吸收峰，突变后的蛋白在缺铁LB中均无红色物质产生，也无528nm的特征性吸收峰;活性测定发现只有野生型IscS具有活性，突变后的蛋白均无活性。 4.有氧条件下IscS中醌型物质在细胞内的累积 纯化后的蛋白在46.5KDa位置有单一目的条带产生;肉眼观察蛋白发现随时间的增加，蛋白的颜色逐渐加深;全波长扫描结果发现随时间的增加，蛋白在528nm处的特征性吸收峰也逐渐上升。 5.醌型物质在体外可被H2O2消除 在IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白中分别加入不同浓度的H2O2，结果发现IscS/iscA-sufA-蛋白原有的528nm特征性吸收峰随H2O2浓度的增加而降低甚至消失。 结论: 1.在正常的LB中加入铁的螯合剂Bipy，可以模拟IscS/iscA-sufA-中的供铁障碍及铁硫簇组装障碍的环境; 2.有氧条件下缺铁LB中IscS/MC4100出现红色物质的累积说明该红色物质是由于供铁障碍引起，厌氧条件下正常LB中均无红色物质产生，而缺铁LB中又都出现红色物质的累积，说明在双敲菌中该红色物质的产生是由于IscS/SufA的缺失引起; 3.突变型IscS蛋白活性消失，且在缺铁LB中不能产生红色物质，说明该红色物质的产生与蛋白的活性相关，只有有活性的蛋白才会有红色物质的累积; 4.IscS/iscA-sufA-中红色随诱导时间的增加逐渐加深，528nm吸收峰也随时间逐渐升高，再次说明该红色物质是酶促反应的中间反应物，且随时间不断累积; 5.IscS/iscA-sufA-与H2O2反应后528nm吸收峰降低甚至消失，说明该红色物质含有共轭双键而易于被氧化。