非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是一类不能编码蛋白、可调控相关基因表达的RNA分子,其在维持机体正常生理功能中发挥重要作用。随着高通量生物芯片和测序技术的应用,结直肠癌(colorectal cancer, CRC)组织和细胞系中发现大量显著差异表达的ncRNA,提示这些RNA分子在CRC的发生和发展中可能作为“癌基因”或“抑癌基因”角色发挥作用。NcRNA功能区遗传多态性可影响其结构、表达和功能,可能影响CRC发病风险、常规化疗药物疗效和患者生存预后水平。CRC患者血清显著差异表达并稳定存在的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)都是CRC临床应用的潜在生物标志物。基于以上研究背景,本课题拟通过文献检索和生物信息学技术筛选并确定CRC相关的lncRNA和miRNA及其潜在功能单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点,分别筛选和整理纳入人群和临床资料,进行3年临床随访工作,并通过MassArray-飞行质谱、qRT-PC R、普通PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA直接测序、荧光素酶报告基因试验、细胞培养、透射扫描电镜、Nanosight检测、western blot和ELISA等技术探讨ncRNA的SNP位点和血清lncRNA作为CRC风险评估、5-FU为基础化疗药物疗效判断、临床预后预测和辅助诊断标志物的临床价值及可能作用机制。在本研究第一部分,我们采用生物信息学技术筛选出在CRC中鲜有报道的13个miRNAs口8个lncRNAs勺24个SNP功能位点,检测总病例数为1358例CRC患者和1079例健康对照人群中的上述24个SNPs基因型,分析其与CRC易感性、5-FU为基础的化疗药物疗效和患者3年临床预后的相关性结果显示CCAT2 rs10808556在共显性(CC vs. TT)和隐性模型(CC vs. TT+TC)下与CRC发病风险呈显著正相关,：niR-608rs4919510位点GG基因型和G等位基因和RPL34-AS1 rs11731416位点GC、CC、GC+CC基因型和C等位基因与CRC发病风险都呈显著负相关,同时rs4919510和rs11731416位点具有协同风险累积效应共同降低CRC发病风险；药物疗效分析显示miR-126 rs4636297和HOTAIR rs2366152与患者DCR显著相关,PCAT1 rs1551513和CCAT2 rs10808556与患者ORR显著相关,RPL34-AS1 rs11731416和miR-373 rs3859501与患者ORR和DCR都显著相关；患者预后分析显示只有C CAT2 rs10808556位点CC基因型携带患者的3年RFS和OS显著短于TT或TT+TC基因型携带者；进一步分析发现CCAT2 rs10808556位点与GWAS鉴定位点rs6983267位点呈连锁不平衡(R2=0.848),同时上述两位点DNA序列存在增强子活性顺式作用元件；萤光素酶报告基因试验结果显示rs10808556位点的C等位基因、rs6983267位点G等位基因都可以单独或组合协同提高荧光素酶报告基因启动子活性；rs10808556位点是SP1和SP2转录因子结合位点,此位点T等位基因与SP1和SP2的预测结合能力显著低于C等位基因；CCAT2和CARLo5在CRC患者癌组织都显著高于癌旁组织,同时rs10808556位点不同基因型与癌组织和细胞系CCAT2和CARLo5表达量显著相关,提示与转录因子SP1或SP2结合能力较强的rs10808556位点C等位基因,可诱导区域较强的DNA增强子活性以提高CCAT2和CARLo5启动子活性,导致CRC癌组织中高表达的CCAT2和CALo5以促进CRC细胞转化、增殖、侵袭和迁移,最终导致CRC的发生、5-FU药物耐药和患者不良预后。在本研究第二部分,我们通过文献检索筛选出18个与CRC发生和发展相关的lnRNAs,在50例CRC患者术前和50例健康个体血清样本中筛选出PCAT1、 CCAT2、UCA1、lncRNA-P21、MALAT1等5个显著差异表达的lncRNAs,其中PCAT1、CCAT2、UCA1和MALAT1在236例CRC患者术前和213例健康个体血清样本中得到进一步验证；ROC曲线分析提示血清MALAT1对CRC诊断效能较低,然而只有血清PCAT1在血清、血浆、溶血、黄疸、脂血、温度、酸碱、反复冻融、DNA和RNA酶处理和不同室温放置等因素处理下可以保持稳定；循环PCAT1对CRC诊断的最佳cut-ofl值为1.615,AUC为0.779,灵敏度为77.54%、特异度为64.32%、准确度为71.27%、NPV为72.11%、PPV为70.66%、Youden指数为41.86%,其诊断价值显著高于CEA和CA199,与CEA或CEA和CA199联合诊断之间AUC无显著性差异,但都优于单—PCAT1诊断价值；血清PCAT1在CRC术后的相对表达量显著降低；同时在50例CRC术前和50例健康个体血清样本中进一步确证血清PCAT1对CRC的诊断价值,提示循环PCAT1可作为临床CRC辅助诊断和术后疗效判断分子标志物；PCAT1在CRC癌组织和HT29和HCT116细胞系中都显著高表达,循环PCAT1相对表达量在CRC术前血清样本和CRC细胞系48h细胞培养液的相对表达量都显著高于术后一个月血清和24h培养液样本,同时全血样本中PCAT1的相对表达量在两组中都无显著性差异,循环PCAT1相对表达量与全血红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、血小板计数都无显著性直线相关性；采用透射扫面电镜、nanosight颗粒视踪仪和western blot验证CRC患者血清中存在exosome, CRC患者exosome样本的PCATl相对表达量显著高其自身exosome-free血清样本,也高于健康个体exosome样本,PCAT1的相对表达量在对照组中exosome样本和exosome-free血清样本中无显著差异,但与患者血清exosome浓度呈显著直线正相关；同时组织、细胞系、全血、血浆、exosome、 exosome-free血清样本中都可检测出PCAT1,通过亚克隆、普通PCR和DNA直接测序技术验证本研究具有CRC诊断价值的RNA片段为87bp的PCAT1来源于被exosome囊泡包裹的总长度大约为320bp的PCAT1片段。综上所述,本研究主要获得以下结果：1. MiR-608 rs4919510和RPL34-AS1 rs11731416是CRC发生的保护性遗传位点。2. MiR-126 rs4636297、miR-373 rs3859501、HOTAIR rs2366152、PCAT1 rs1551513、RPL34-AS1 rs11731416、CCAT2 rs10808556影响CRC患者5-Fu为基础化疗药物临床疗效。3CCAT2 rs10808556位点通过影响转录因子SP1和SP2的结合,介导不同增强子活性,诱发CCAT2和CARLo5的紊乱表达,促进CRC的发生、降低5-FU化疗药物疗效和诱发患者临床不良预后水平,此位点CC基因型可作为CRC风险评估、5-FU化疗药物疗效判断和患者临床预后判断的分子标志物。4.循环差异表达的PCAT1来至于CRC患者肿瘤细胞释放入血的exosome颗粒,小片段PCAT1在exosome的包裹下不受溶血、脂血、黄疸、强酸强碱、温度、不同放置时间、DNA和RNA酶和反复冻融等因素影响,在血清中稳定存在。5.循环PCAT1用于诊断CRC的最佳cut-off值为1.615,AUC为0.779,灵敏度为77.54%、特异度为64.32%、准确度为71.27%、NPV为72.11%、PPV为70.66%、Youden指数为41.86%,与CEA联合可以提高其对CRC的诊断价值,其可作为CRC辅助诊断和术后疗效判断分子标志物。