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人博卡病毒（Human bocavirus,HBoV）属细小病毒科细小病毒亚科,博卡病毒属,是继细小病毒B19之后新发现的第二个对人类致病细小病毒科成员。自2005年HBoV1被发现以来,各国研究学者相继在人呼吸道、粪便、血清、脑脊液等标本中检出4个基因型别（HBoV 1-4）,在世界范围内广泛流行。HBoV1常见于儿童急性呼吸道感染,可引起轻症、重症不同程度的呼吸道感染,甚至有单一感染致死性病例报道。HBoV2是急性腹泻患儿粪便标本中的主要HBoV型别,检出率为0.8%～26.0%。推测可能是HBoV1与HBoV2的组织嗜性不同,导致HBoV1以呼吸道感染为主,而HBoV2以肠道感染为主。冷冻电镜和3D图像重建技术对HBoV1、HBoV3、HBoV4的VP3蛋白进行结构重建,发现两个重要结构域（VRⅦ、VRIX）差异可能造就了种属易感性差异,但另两个结构域（VRⅤ、VRⅢ）差异可能导致不同基因型别的抗原性不同,产生组织嗜性差异。而决定病毒组织嗜性的关键不仅包括病毒衣壳上与宿主细胞结合的特定区域,同时与病毒互作的宿主蛋白也影响病毒对宿主的感染能力。为确定HBoV1与HBoV2的组织嗜性差异,开展了如下工作:1.为寻找决定HBoV1与HBoV2组织嗜性的关键区域,选择衣壳蛋白VP3作为靶标,以存在至少8个以上氨基酸差异、抗原肽指数高作为基本筛选标准,通过MEGA7进行氨基酸序列比对,进一步利用ProtScale、Jpred4和SWISS-MODEL预测差异区域的二级和三级结构,将具有显著结构差异的区域确定为组织嗜性相关区域。随后,根据差异区域（DR）序列合成多肽,免疫兔,获得抗DR兔血清（anti-DRs）,以在大肠杆菌（E.coli）中表达的VP3作为抗原,应用Western blotting、ELISA和生物膜层干涉技术明确了 anti-DR与不同基因型HBoV的识别和结合能力。最后,应用HBoV1 DNA 阳性的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物作为间接免疫荧光试验（IFA）的抗原,确定各抗体的型别特异性。结果显示,HBoV1与HBoV2 VP3有四个差异区域DR1-4,不仅在氨基酸水平,在二级结构与三级结构也存在显著差异,尤其是HBoV2 VP3上的DR2区域缺失了 HBoV1 VP3中存在的四个保守氨基酸204GNAA207,这一结构差异导致该区域三级结构一个半环的缺失。由HBoV1或HBoV2的各四个区域（DR1-4）推导出的8个多肽免疫后获得anti-DRs,Western blotting、ELISA和生物膜层干涉技术的型别特异性检测结果显示仅有anti-DR2具有基因型别特异性,这一特异性结果在呼吸道阳性标本中应用IFA得到验证。综上所述,VP3的DR2（195-220aa位点）被确认为基因型特异性区域,这可能是HBoV1和HBoV2之间潜在的组织嗜性决定性因素之一。2.为寻找可能是组织嗜性决定因素的与病毒互作的宿主蛋白,进行了HBoV1与HBoV2与病毒互作的宿主差异性分析。首先在肠道细胞系Caco2中表达了 HBoV1和HBoV2的主要衣壳蛋VP3;通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）将与 HBoV1 及 HBoV2 VP3 结合的 Caco细胞上的蛋白通过Strep标签蛋白结合到Meg-Strep Beads上进行共沉淀,将互作蛋白进行胶内酶解,经Ziptip C18固相萃取,使用Orbitrap ExplorisTM 240质谱仪分析鉴定多肽混合物,通过生物学软件MaxQuant（version 2.0.1.0）检索质谱输出数据,用生物学软件OmicsBox（1.2.4）对差异定量蛋白和差异蛋白进行GO富集及相关通路分析。最终,本研究筛选出相互作用差异显著的内源靶蛋白50个,其中VAMP8与HBoV2 VP3的结合量是与HBoV1 VP3结合量的10倍以上（P＜0.001）,推测VAMP8可协助病毒进入宿主细胞,且Caco2内环境更适于HBoV2 VP3表达。BPIFA1与HBoV1 VP3结合量是与HBoV2 VP3结合量的10倍以上（P＜0.001）,且BPIFA1与HBoV1 VP3结合位点位于有型别结构差异的DR3区域。由于BPIFA1大量表达于气道上皮,推测HBoV1 VP3靶向BPIFA1感染呼吸道上皮细胞。总之,本研究从病毒及宿主两方面进行了 HBoV1与HBoV2组织嗜性差异决定性因素研究。HBoV1与HBoV2间主要衣壳蛋白VP3的差异区域DR1-4中,能够诱导具有型别特异性抗体产生的区域为DR2;通过与肠道细胞系进行蛋白互作分析发现的两个与VP3作用差异显著蛋白VAMP8和BPIFA1,可能分别是HBoV2与HBoV1的内源性靶蛋白。上述结果为深入研究HBoV1与HBoV2组织嗜性差异奠定了基础。