[研究背景]人外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞(Cytokinesis-blocked,CB法)微核实验已在辐射生物剂量学、放射工作人员健康评价、遗传毒理学等领域中获得了广泛应用。尤其是CB法微核实验可以作为一种成熟、可靠的辐射生物剂量计,具有经济、简便、准确等优点,能够准确估算0.25-5Gy之内各种射线(α粒子除外)引起的受照剂量。迄今为止,CB法微核样本都是靠人工镜下读片分析,这样费时、费力、存在主观差异,难以满足大批量放射工作人员健康评价和核事故后大批辐射伤员受照剂量快速估算的迫切需要。流式细胞仪和激光扫描细胞仪均不能用于CB法微核的自动检测,而图像自动分析方法具有较大的潜力。但是,由于CB法微核图像自动化分析所涉及的关键技术多、研究难度大、学科交叉性强,一直都未能实现。国外有少数文献报道过微核图像分析方面的研究,但是双核细胞、微核的识别能力和准确率均不高；国内仅有少数学者提出了CB法微核图像自动分析的希望,却未见实质性的研究报道。[研究目的]解决CB法微核图像自动分析所涉及的各项关键技术和难题,初步研制一套识别能力强、识别准确率高、识别速度快、完全自动化的CB法微核图像分析系统,以提高CB法微核实验的分析速度,实现分析标准的规范化和统一化,将工作人员从枯燥乏味的读片工作中解放出来,以满足大批量放射工作人员健康评价的迫切需要、满足核事故发生后大批伤员剂量快速估算的需要。[实现方法]1.在本实验室现有的CB法微核样本制备基础上,摸索更高质量微核样本的制备方法,为后续微核图像的自动分析提供优质图像。2.利用本实验室的Zeiss-AX10显微镜(物镜20×)和MetaSystem (Metafer4)自动载物台实现CB法微核图像的自动采集,将每张微核样片全片扫描成2117幅尺寸为1280×1024pixel、tif格式的灰度图像。3.采用图像分析和模式识别方法,利用MATLAB7.1编程依次解决以下关键技术：(1)对CB法微核图像进行预处理,以提高微核图像的质量；(2)实现CB法微核灰度图像的迭代双阂值自动分割,分别将细胞区域、细胞核及微核从图像中分割出来；(3)对图像特征参数进行筛选和降维,通过计算面积、延展度、缺陷率等参数实现目标区域的识别与分类；(4)对传统的watershed分离算法进行改进,解决其过分离难题,从而实现粘连目标区域自动分离,包括粘连细胞、粘连细胞核、粘连的微核与主核；(5)利用细胞内的细胞核个数、双核面积比参数、目标区域面积大小等信息实现双核细胞与单核、多核细胞的区分,实现双核细胞的自动识别；(6)对于识别出的双核细胞,若其内部有三个或三个以上的目标区域(包括两个主核),再利用形态特征参数阈值实现微核的自动识别；4.采用MATLAB7.1的GUI工具实现该自动分析系统,主要包括微核图像的批量读取模块、空白图像的预剔除模块、双核和微核的自动识别与计数模块、识别结果的人工校对模块、分析结果自动显示模块,等。5.以不同剂量的质子照射和60Co-γ射线照射后的人外周血淋巴细胞的CB法微核样本为测试对象,利用研制出的CB法微核图像系统进行双核细胞和微核的计数分析,完成系统的性能指标测试,并对自动识别结果和人工分析结果进行对比分析。[研究结果]1.建立了一套制备高质量CB法微核样本的流程,可为后续的微核图像自动化分析提供优质图像,同样也有益于人工镜下分析。2.解决了CB法微核图像自动分析所涉及的关键技术和难题,主要包括：(1)CB法微核图像的迭代双阈值分割；(2)CB法微核图像中目标区域的自动分类；(3)粘连目标区域的自动分离；(4)双核细胞的自动识别与计数；(5)微核的自动识别与计数。3.采用MATLAB7.1语言及其GUI设计功能为开发平台,初步研制出了一套实用的CB法微核图像的自动分析软件系统。4.完成了CB法微核图像自动分析系统的性能测试。测试结果表明,本系统的双核细胞识别能力约为82.42%、识别准确率为85.70%；微核的识别能力为73.89%、准确率为85.28%；每张样片的全片分析时间<3h,达到预定设计要求。5.系统研制过程中获得了一系列实用的图像分析技术和算法,这些算法对于其它种类图像的自动分析和模式识别也是有益的,比如：(1)设计了简洁、高效的灰度图像的迭代双阈值分割算法。(2)采用四邻域和八邻域结构元素交叉进行极限腐蚀,代替传统的采用单一结构元素进行极限腐蚀的方法,充分克服了连续腐蚀过程中的单一结构元素的不同方向上的像素堆聚问题。(3)改进了传统的watershed分离算法,克服了其公认的缺陷(过分离问题),既可将其用于简单粘连区域的自动分离,又可用于复杂粘连区域的分离,还可用于不同形状、不同尺寸粘连区域的分离。改进后的分离算法具有高效、分离效果理想等优点,能胜任各种凸性颗粒组成的粘连区域的自动分离。(4)设计了一种高效、准确的双核细胞识别方法,使得双核细胞与单核、多核细胞的区分、微核的自动识别等难题迎刃而解。[结论]本文不仅成功解决了CB法微核图像自动分析所涉及的各项关键技术和难点,还初步研制成功了一套CB法微核图像自动分析系统。该系统能够用于大批量放射工作人员的健康评价、用于核事故发生后或核武器使用后大批量伤员的剂量快速估算,还可用于致癌、致突变物的筛选等,将具有显著的社会效益和重要的军事意义。迭代双阈值分割算法获得淋巴细胞的轮廓信息,而改进的Watershed算法能够有效分离CB法微核图像中的粘连目标区域,使得双核细胞的识别能力、准确率,以及微核的识别能力等指标优于国外的研究报道。本系统的分析速度在可接受的时间之内,每张微核样片全片分析的时间<3h。本系统的成功研制还为研制其它种类的微核图像系统、以及其它种类的医学图像自动分析提供了技术支持和保障。本文主要解决了CB法微核图像自动分析的软件部分,今后工作中将进一步优化和完善该自动分析系统,使其能够得到广泛的应用。