论文部分内容阅读
[背景与目的]
MUC2基因定位于染色体11p15.5,编码一种主要存在于肠道的分泌型黏蛋白。与正常结直肠组织中MUC2表达水平相比,结直肠非黏液腺癌中MUC2的表达下调,但黏液腺癌中却可见其表达较高。这些现象提示,在结直肠肿瘤的发生发展过程中,存在MUC2表达的异常改变,结直肠黏液与非黏液腺癌中可能存在不同的MUC2表达调控机制。结直肠癌中MUC2表达的差异是否与肿瘤的发生发展以及增殖、侵袭、迁移等生物学行为相关仍需深入研究。本研究旨在探讨MUC2表达与结直肠肿瘤发生发展及肿瘤细胞恶性生物学行为的关系,以期进一步明确MUC2与结直肠癌的相关性,为结直肠癌的防治提供实验依据。
[方法]
1.收集临床病理石蜡标本,免疫组织化学技术检测6例正常结直肠组织(normalmucosae,NM)、12例增生性息肉(hyperplastic polyps,HP)、15例管状腺瘤伴低级别异型增生(low-grade dysplasia,LGD)、14例管状腺瘤伴高级别异型增生(high-gradedysplasia,HGD)、26例非黏液腺癌(non-mucinous carcinomas,NMC)、15例黏液腺癌(mucinous carcinomas,MC)和8例印戒细胞癌(signet-ring cell carcinomas,SRCC)中MUC2蛋白的表达。
2.检索数据库,纳入应用免疫组织化学技术检测MUC2蛋白表达与结直肠癌临床病理特征相关性的文献,进行Meta分析。
3.实时定量PCR检测Caco-2、HT-29、LoVo和LS174T四种结直肠癌细胞株中MUC2mRNA的表达,筛选出MUC2mRNA高表达细胞株作为靶细胞进行RNAi。
4.构建4个pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR重组干扰质粒和1个阴性对照质粒,测序鉴定,瞬时转染靶细胞,采用实时定量PCR检测各转染细胞内MUC2mRNA的表达水平,筛选出干扰效果最佳的载体。
5.干扰效果最佳的重组质粒和阴性对照质粒稳定转染靶细胞,建立稳定转染细胞株,实时定量PCR和Western blot技术检测稳定转染细胞株中MUC2mRNA和蛋白的表达水平。
6.MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验检测稳定转染细胞株增殖、侵袭和迁移能力的变化。
7.建立裸鼠移植瘤模型,观察稳定转染细胞株裸鼠体内成瘤情况,移植瘤组织H.E.染色,观察肿瘤组织形态,免疫组织化学技术检测移植瘤组织中MUC2、Ki67和MMP-9蛋白表达水平的变化。
8.采用一定浓度和作用时间的Notch信号通路抑DAPT处理靶细胞,实时定量PCR和Western blot技术检测Hes1、Math1、MUC2mRNA和蛋白表达水平的变化。
9.MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验检测Notch信号通路抑制剂DAPT对靶细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。
[结果]
1.免疫组织化学结果显示,NMC组中MUC2蛋白表达水平最低(46.15％),统计学分析表明,在HP-LGD-HGD-NMC序列中,呈现MUC2蛋白表达的顺序下降(r=-0.73436,P＜0.0001),而结直肠癌组织中,MC组和SRCC组的MUC2蛋白表达水平明显高于NMC组(P＜0.05)。
2.Meta分析显示,MUC2蛋白在结直肠黏液腺癌中的阳性率明显高于非黏液腺癌((RR,2.10;95%CI,1.30-3.40;P=0.002),而远端结直肠癌中MUC2蛋白的阳性率明显低于近端结直肠癌(RR,0.74;95%CI,0.64-0.85;P=0.000)。T3& T4期结直肠癌患者中MUC2蛋白表达略高于T1& T2期,但统计学检验并无明显差异(RR,1.17;95%CI,1.00-1.37;P=0.052)。MUC2蛋白表达阳性率在低分化vs高中分化组、N1& N2& N3vsN0组、M1vsM0组中均未见明显差异。
3.实时定量PCR检测结果显示,四株结直肠癌细胞中,Caco-2的MUC2mRNA表达量最低,HT-29、LoVo和LS174T中MUC2mRNA的表达水平分别是Caco-2的15-60±7.72、68.12±3.70、75±58+26.90倍。四种结直肠癌细胞株中,LS174T细胞的MUC2mRNA表达量最高,因此后续实验中使用LS174T作为靶细胞,进行RNAi。
4.经过测序比对,各重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致,因此四个干扰载体构建成功。构建成功的各干扰质粒分别瞬时转染LS174T细胞后,实时定量PCR检测结果显示,pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-2干扰载体的基因沉默效果最佳,因此选用该质粒建立稳定转染细胞株。
5.实时定量PCR和Western blot结果显示,pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-2干扰载体稳定转染LS174T细胞后,下调了LS174T细胞内MUC2mRNA和蛋白的表达水平。
6.MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验结果显示,通过RNAi下调了LS174T细胞内MUC2的表达后,MUC2-RNAi组肿瘤细胞培养96h后的OD值为1.68±0.04,克隆形成数量为383.00±19.52个/孔,培养24h后侵袭细胞数量为114.80±3.34个细胞/200倍视野,培养12h后迁移细胞数量为133.33±7.52个细胞/200倍视野,与各对照组相比,MUC2-RNAi组肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力均明显增加(P＜0.05)。
7.体内实验显示,皮下接种后的21只裸鼠全部成瘤,成瘤率为100%,平均成瘤时间为6±d。种植后第13d,处死动物,各组肿瘤体积分别为205.19±52.57mm3(control-blank组)、229.61±41.69mm3(control-negative组)和675.76±170.17mm3(MUC2-RNAi组),MUC2-RNAi组肿瘤体积明显大于各对照组(P＜0.05)。各移植瘤组织H.E.染色后,可见肿瘤细胞排列成条索状、片状,部分肿瘤组织内可见小片坏死灶。免疫组织化学结果显示,MUC2-RNAi组内MUC2蛋白的表达明显低于各对照组(P＜0.05),而Ki67和MMP-9蛋白的表达却明显高于各对照组(P＜0.05)。
8.实时定量PCR和Western blot实验结果显示,20μM的DAPT处理LS174T细胞48h后,与control-DMSO组相比,DAPT组肿瘤细胞的Hes1、Math1、MUC2mRNA表达水平均明显下调(P＜0.05),各蛋白表达情况与其mRNA变化相一致。
9.MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验结果显示,20μM的DAPT处理LS174T细胞后,DAPT组肿瘤细胞培养48h后的OD值为0.30±0.01,克隆形成数量为164.33±19.60个/孔,培养24h后侵袭细胞数量为33.00±1.40个细胞/200倍视野,培养12h后迁移细胞数量为50.93±3.30个细胞/200倍视野,与各对照组相比,DAPT组肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力均明显降低(P＜0。05)。
[结论]
1.结直肠癌发生过程中存在MUC2蛋白的表达变化,黏液腺癌和印戒细胞癌的发生可能不同于传统的腺瘤—腺癌序列。
2.结直肠黏液腺癌及近端部位结直肠癌中MUC2蛋白表达较高。此外,T3和T4期结直肠癌中亦趋向于表达较高的MUC2蛋白,但尚需进一步的大样本研究来加以证实。
3.利用RNAi技术成功下调结直肠癌LS174T细胞中MUC2的表达后,细胞水平和动物实验水平的研究结果均显示,MUC2表达的下调促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力,提示MUC2的表达与LS174T细胞的恶性生物学行为相关。
4.Notch信号通路抑制剂DAPT可以阻断LS174T细胞中Notch信号的活性,上调细胞内MUC2的表达水平,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力,提示该信号通路参与肿瘤细胞MEJC2表达及恶性生物学行为的调控。