论文部分内容阅读
寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属,于1947年在乌干达首次被发现。根据系统进化分析,ZIKV可以分为非洲型和亚洲型。虽然ZIKV很早就被发现,但是直到2015年在南美的忽然暴发,并迅速扩散到80个国家后才开始引起人类的关注。ZIKV主要通过蚊虫叮咬在人群中传播,ZIKV的感染可以引起成年人严重的神经系统并发症,孕妇感染会导致新生儿先天畸形如小头症等,并且ZIKV可以通过血睾屏障对男性睾丸造成损伤。2016年2月,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将ZIKV感染列为全球公共卫生紧急事件。ZIKV与其他的黄病毒如登革病毒(dengue virus,DENV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)以及日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)等有着同样的基因组结构,均为单股正链RNA,在被感染的宿主细胞质中,该基因组翻译出一条长的多蛋白。这个长蛋白后期会继续被宿主或者病毒自身的蛋白酶酶切加工成3个结构蛋白[膜蛋白(membrane glycoprotein,prM/M)、囊膜蛋白(Envelope protein,E)、核衣壳蛋白(Capsid protein,C)]以及 7 个非结构蛋白(nonstructural protein,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。结构蛋白构成了病毒粒子,而非结构蛋白则在病毒基因组复制、多蛋白的加工、拮抗宿主的免疫反应等方面发挥了重要的作用。本文主要的研究对象是寨卡病毒非结构蛋白NSI。作为非结构蛋白,在细胞内,NS1以同源二聚体的形式存在,对病毒基因组复制是必须的;同时,NS1还可以与脂质分子结合,以六聚体脂蛋白的形式分泌到细胞外(sNS1)。分泌到细胞外的NS1通过与宿主免疫系统以及其他的宿主因子相互作用,帮助病毒进行免疫逃逸并且引起各种疾病。此外,NS1还是黄病毒感染的主要抗原标志,可以与其他标志分子一起作为检测黄病病毒感染的生物标记。DENV和WNV NS1致病的分子机制已经研究得较透彻。解析ZIKV NS1的晶体结构,并且分析结构的共性与特异性等对于判断之前的研究数据是否同样适用于ZIKV十分重要。本研究首先解析了 ZIKV NS1全长蛋白的晶体结构。ZIKV NS1整体结构与DENV2和WNV NS1类似,都以同源二聚体的形式存在,每个单体包括三个结构域:β-发卡结构域(β-hairpin domain)、侧翼结构域(wing domain)以及一个由β折叠片形成的梯子样结构域(β-ladder domain)。NS1二聚体含有两个截然不同的表面:在二聚体的内表面,β桶结构(β-roll)、连接结构域和侧翼结构域的长loop的后半段形成了一个不连续的线性的极度疏水的表面,这个表面可能帮助NS1参与膜结合;而二聚体的外表面则是极性亲水的。在NSI的六聚体结构中,3个二聚体的极性面朝外,疏水面包裹着脂质分子,形成脂蛋白。ZIKVNS1结构的解析使我们看到了之前在DENV2和WNVNS1结构中没有观察到的wing domain中长loop的后半段。这个长的loop含有3个疏水的氨基酸(Y122F123V124),它与(3桶结构、连接结构域一样,均为疏水的突起,这个疏水的刺突可能有助于NS1参与膜结合。此外,与已有的DENV2和WNV NSI结构比较,ZIKVNS1结构具有独特的电荷表面:在B梯子结构域的loop区、内表面的1B桶结构以及wing结构域外表面的顶端,ZIKVNS1均展现出与众不同的电荷分布。ZIKVNSI独特的表面特征可能与ZIKV的神经毒性等有关,我们可以利用ZIKVNS1独特的表面性质开发新的针对ZIKV的治疗和诊断工具。接着我们通过体外和体内实验验证了在ZIKV NS1 wing domain中首次观察到的interwined loop上由Y122 F123 V124三个疏水氨基酸形成的刺突(spike)在膜结合中的重要性。脂质体上浮实验表明,122-124位突变体蛋白ZIKV NS1-AAA和ZIKV NS1-GGG与脂质体的结合能力较ZIKV NSl-wt减弱;利用反向遗传学学技术构建的ZIKV NS1-AAA、ZIKV NS1-GGG三点突变的病毒在Vero细胞中完全失去复制的能力。与野生型ZIKV相比,ZIKVNSI Y122A、ZIKV NSlF123A、ZIKVNSIV124A单点突变的病毒在细胞内的复制能力减弱;在小鼠模型中(n=5),野生型病毒和NSIV124A突变体病毒组的小鼠全部死亡,而Y122A组的小鼠死亡了 2只,F123A组的小鼠则全部存活。这表明NS1 Y122以及F123残基在病毒复制中的重要性,当该位点突变之后,病毒毒力减弱甚至完全失去了毒力。以上的数据均表明NSI 122-124三个位点形成的“spike”对于NS1参与膜结合以及随后的病毒复制是不可或缺的。被黄病毒感染的患者早期血液中有高水平的NS1存在,可以根据NS1的这个特性开发针对ZIKV感染的血清学诊断工具。此外,NS1还可以作为预防黄病毒感染的疫苗靶标。因此我们以ZIKV NS1为免疫原免疫小鼠,获得了 14株单克隆抗体,并对它们的相关特性进行了研究。这些数据为进一步深入研究抗体发挥作用的分子机制及表位信息,以及开发基于ZIKVNS1的病毒感染检测试剂盒奠定了基础。