【摘 要】
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人腺苷酸激酶(hAK1)广泛参与人体各个器官中的能量代谢和平衡过程,它在Mg2+离子作用下可逆催化两分子ADP,生成一分子ATP和一分子AMP,并伴有高能磷酸基团的转移。hAK1的氨基酸突变会导致中度至重度的非球型性溶血性贫血,这是一种罕见的遗传性酶病。为了揭示氨基酸突变致病的分子机制,我们重组制备了临床上报道的7个hAK1溶血性贫血致病突变体(Q24R、G40R、G64R、R97W、R128W、
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人腺苷酸激酶(hAK1)广泛参与人体各个器官中的能量代谢和平衡过程,它在Mg2+离子作用下可逆催化两分子ADP,生成一分子ATP和一分子AMP,并伴有高能磷酸基团的转移。hAK1的氨基酸突变会导致中度至重度的非球型性溶血性贫血,这是一种罕见的遗传性酶病。为了揭示氨基酸突变致病的分子机制,我们重组制备了临床上报道的7个hAK1溶血性贫血致病突变体(Q24R、G40R、G64R、R97W、R128W、R138H、delD140),并对它们的结构和功能进行了探究。我们通过酶偶联反应,测定了 hAK1野生型和各个突变体的酶活性,结果表明这些突变体的催化效率与野生型相比降低了 85%以上。通过对比野生型和突变体的2D 1H-15N HSQC核磁谱,我们发现与野生型相比,R97W的和R128W的主链谱峰发生了明显的变化,推测它们与野生型hAK1的三维结构差异较大。因此,我们拟通过比较野生型和突变体的三级结构和主链动力学的特征,来揭示突变体致病的结构基础和分子机制。首先,我们通过结晶条件的筛选与优化,得到了 R128W突变体的蛋白质晶体。我们利用X射线晶体衍射技术,解析了突变体R128W的晶体结构,其分辨率为2.2?,空间群为P41212,Rwork/Rfree值为0.2050/0.2509,已提交到蛋白质数据库中(PDBID:7DE3)。同时,我们以与hAK1同源度高达95.36%的susAK1晶体结构(PDB ID:3ADK)为模板,同源建模得到野生型hAK1结构。我们通过比较野生型hAK1与R128W突变体的结构,发现R128W突变后导致hAK1的LID结构域呈现出更为“开放”的状态,这使得其与底物结合时形成“闭合”构象的难度增加,同时结合底物的关键位点如R128、R132和R149等远离了结合口袋,与底物的相互作用遭到破坏。此外,LID结构域的构象变化还会使得结合口袋的正电荷分布状态由集中变为相对分散,影响其与底物的结合,进而限制其催化功能。ITC实验结果表明,突变后R128W与R97W与底物的亲和力分别降低了 61%和 56%。其次,我们完成了 hAK1野生型和突变体R128W的主链原子化学位移指认,其中野生型的完成度为94.1%(177/194),R128W的完成度为88.8%(167/194)。我们还对比了hAK1野生型和突变体R128W的动力学特征,利用Sparky软件对纵向驰豫速率R1、横向弛豫速率R2和异核稳态NOE数据进行分析,并通过Fast-Modelfree软件对弛豫实验的数据进行计算分析得到描述主链化学键在ps-ns时间尺度内的内运动的广义序参数S2、内部运动相关时间τe以及构象交换速率Rex。研究结果表明R128W突变后,hAK1蛋白的不对称性提高,突变后的LID结构域柔性明显增强,而CORE结构域和NMP结构域则无明显变化,与晶体结构结果相符。同时,R128W突变体中与LID结构域相连的β4折叠和loop上集中出现了Rex值(L115、L116、D119及A120),说明这些区域的分子内运动模式可能受到LID结构域构象变化的影响,功能可能随之受到影响,因此该片段也可能与突变体R128W的致病性相关。综上,本论文测定了 R128W突变体的三级结构和主链动力学特征,并与野生型hAK1进行了比较,揭示了 R128W突变引发溶血性贫血疾病的结构基础,为设计和研发特异性的治疗药物提供了理论依据。
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