明确梅毒螺旋体(Treponema pallidum, TP)的致病因子及进行TP致病机制的研究,将为研制TP抗感染疫苗和开发TP感染治疗新药提供科学依据,是防治本病的关键环节。然而,迄今为止,由于TP体外人工培养尚未成功,抗原获取困难,限制了对TP的深入研究,以致TP的致病机制目前尚未被阐明。炎症和持续的获得性免疫应答被认为是造成TP感染后机体病理损伤的主要原因。研究表明,TP膜蛋白是介导炎症反应的主要成分,可能为TP的主要致病因子,因此对TP膜蛋白的研究是认识其对宿主的致病性和进行致病机制研究的关键。但是对于具体是哪些TP膜蛋白在发挥这方面的作用报道甚少,因而有必要进行TP膜蛋白的致病性研究和筛选,这对深入研究TP的致病机制至关重要。Tp0751为近年来新发现的一种TP主要的黏附膜蛋白,其主要介导TP与宿主细胞的结合而与TP入侵宿主有关,是机体较早接触的TP膜蛋白之一。那么其在TP致病过程中是否还具有其他的作用呢?譬如,其是否具有细胞毒性?其是否能够诱导宿主免疫细胞产生前炎症反应而与介导机体的炎症反应有关呢?这些均值得深入探索和研究。本研究试图通过探讨Tp0751黏附蛋白的免疫活性、细胞毒性及是否能诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子(CKs)TNF-α、IL-1β和IL-6,并初步研究其诱导CKs产生的信号传导通路,为进一步探索Tp0751黏附蛋白在TP感染免疫中的作用及进行梅毒的致病机制研究奠定重要的基础。通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,以TP Nichols株的基因组DNA为模板,PCR扩增Tp0751基因；通过BamHI和EcoRI酶切位点将Tp0751基因克隆进pET-28a(+)质粒中构建重组质粒,筛选阳性质粒,酶切鉴定和PCR鉴定,经测序鉴定的重组质粒转化至表达宿主菌ER2566中构建原核重组表达体；进行诱导表达,Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度。Western blot检测其免疫反应性；用重组蛋白免疫新西兰兔,检测兔免疫血清中多克隆抗体的效价,评价其免疫原性。利用Detoxi-Gel内毒素去除胶去除重组蛋白中的内毒素；将重组蛋白经皮下注入新西兰兔大腿内侧,观察注射部位皮肤变化；佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导THP-I细胞转化为巨噬细胞,将经内毒素去除处理后的Tp0751重组蛋白分别刺激巨噬细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出率和NO释放量研究其细胞毒性。为研究Tp0751诱导炎症反应作用,以去内毒素的Tp0751蛋白刺激THP-1细胞,检测其产生前炎症细胞因子(CKs)TNF-α、IL-1β和IL-6的情况,同时用LPS做阳性对照和PBS为阴性对照组。为了探讨诱导CKs产生的信号传导通路是否与TLR2、CD14、MAPKs和NF-κB有关,分别用TLR2抗体、CD14抗体、PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)、SP600125 (SAPK/JNK特异性抑制剂)SB203580(p38特异性抑制剂)和PDTC (NF-κB特异性抑制剂)预处理THP-1细胞,然后再用Tp0751刺激细胞,检测细胞因子的产生情况；Western blot检测Tp0751刺激THP-1细胞后细胞MAPKs磷酸化水平和NF-κB的活化情况。PCR扩增得到一大小约为600 bp的目的基因片断(Tp0751去信号肽片段,Tp0751基因全长度为764 bp,编码255个氨基酸)；构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片断为Tp0751目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致；SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组工程菌表达了一相对分子量(Mr)约为26kDa的目的蛋白条带,目的蛋白在菌体细胞内主要以可溶性形式存在;经Ni-NTA亲和纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白,BCA法测得纯化蛋白浓度为1.2 mg/mLWestern blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性反应；利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价到第四次免疫时达到顶峰,其抗体滴度在1:10 240以上。重组蛋白能诱发新西兰兔产生迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity, DTH),注射部位出现明显红肿,红肿部位皮肤温度比对侧相应部位高,于注射后6-1Od红肿消退,生理盐水对照部位未见反应；经Tp0751重组蛋白刺激后的巨噬细胞LDH漏出率和NO释放量较低,和6-His-Tag蛋白作用组比较,差异无统计学意义,与蛋白刺激浓度无关。Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,其能以剂量和时间依赖方式诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,诱导THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6的最适Tp0751刺激浓度为5μg/mL,Tp0751刺激细胞6h后即可从培养基中检测到TNF-α、IL-1β和IL-6,随着刺激时间的延长炎症因子的产生量逐渐增加,而刺激48h(TNF-α、IL-1β)和24 h(IL-6)产生的量则达到高峰。TLR2抗体、CD14抗体能明显抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的产生,并且TLR2和CD14抗体联合处理组对于CKs产生的抑制率明显高于单独处理组；SAPK/JNK特异性抑制剂SP600125对TNF-α、IL-1β和IL-6的产生无明显影响；ERK1/2特异性抑制剂PD98059能较低程度抑制TNF-a的产生,但对IL-1β和IL-6的产生无明显影响；而p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂PDTC能明显抑制TNF-a, IL-1β和IL-6的产生,且呈剂量依赖关系；Tp0751重组蛋白刺激THP-1细胞后,Western blot能检测到明显的磷酸化的SAPK/JNK、p38和ERK1/2条带,60 min达到高峰(P-JNK 45 min后达到高峰),随后逐渐下降,可持续到90 min以上(P-JNK 60 min后基本消失)；同时Western blot检测结果表明,NF-ΚB抑制剂PDTC能部分抑制NF-κB从胞浆转位至胞核,而未用PDTC处理的细胞核抽提物中发现Tp0751重组蛋白能明显激活NF-κB,在细胞核中能检测到明显的NF-κB蛋白条带结果。1)成功构建了pET-28a(+)-Tp0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了高含量的相对分子量约为26 kDa的可溶性融合蛋白；2)Tp0751重组蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体；3) Tp0751重组蛋白诱发新西兰兔产生明显的DTH反应；4) Tp0751重组蛋白对THP-1细胞无明显的细胞毒性作用；5) Tp0751重组蛋白可以诱导THP-1细胞以时间和剂量依赖方式表达CKs(IL-1β、TNF-α和IL-6),可能为TP的一个新的重要的致病因子；6)Tp0751重组蛋白诱导THP-1表达CKs的信号传导可能与TLR2和CD14途径有关；7)Tp0751重组蛋白能激活THP-1细胞内的MAPKs和NF-κB,从而表达CKs。