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目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜组织过度增生和软骨、骨破坏为特征的疾病。目前证实对RA骨质破坏具有治疗作用的药物是改善病情抗风湿性药物(disease modifying antirheumatic drug,DMARDs),但该类药物的有效性有限,且毒副作用明显。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是滑膜炎中组织损伤和基质重塑的直接效应细胞。本研究拟通过体外培养大鼠FLS,给予重组小鼠巨噬细胞移动抑制因子(recombinant mouse macrophage migration inhibitory factor,rmMIF)、雷公藤多苷(Tripterygium glycoside,TG)、人参皂苷(ginsenoside,GS)进行干预,观察大鼠FLS增殖情况,检测与骨破坏相关的细胞因子:细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)的表达,从而观察rmMIF对大鼠FLS增殖及产生骨破坏相关因子的影响,观察中药有效成分TG、GS及其配伍对rmMIF诱导的大鼠FLS增殖及其表达骨破坏相关因子的抑制效应,并探讨其机制。方法:1取大鼠FLS细胞株RSC-364,常规复苏,培养,传代,实验用3-5代滑膜细胞。2实验分组如下:空白对照组、MIF组、MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+TG+GS组、MIF+甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组。3通过MTT法所测OD值判断药物对FLS增殖的影响。4免疫组织化学染色法分别检测大鼠FLS上OPG、RANKL的表达,并进行半定量分析。5收集上清液,然后用ELISA方法检测OPG、RANKL含量;用放射免疫方法检测TNF-α、IL-1β含量。6所有数据均采用SPSS for windows 13.0软件包进行统计学处理。实验结果用均数±标准差(x±s)表示。组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法,P<0.05认为有统计学意义。结果:1 rmMIF对大鼠FLS增殖及表达骨破坏相关因子的影响1.1 rmMIF对大鼠FLS增殖的影响rmMIF可促进大鼠FLS增殖:与空白对照组OD值相比,MIF组均数较高,有统计学意义(P=0.004)。1.2 rmMIF对大鼠FLS表达OPG的影响未显示出rmMIF对大鼠FLS表达OPG的影响:空白对照组与MIF组的细胞OPG标记指数无统计学差异(P=0.117);经完全随机方差分析,各组上清液OPG浓度无统计学差异(P=0.400)。1.3 rmMIF对大鼠FLS表达RANKL的影响rmMIF可促进大鼠FLS表达RANKL:与空白对照组的细胞RANKL标记指数相比,MIF组均数较高,有统计学意义(P=0.044);与空白组相比,MIF组上清液中RANKL浓度显著增高,有统计学意义(P=0.001)。1.4 rmMIF对大鼠FLS表达RANKL/OPG比值的影响rmMIF可促使大鼠FLS培养上清液中RANKL/OPG值升高:与空白对照组相比,MIF组的RANKL/OPG值较高,有统计学意义(P=0.001)。1.5 rmMIF对大鼠FLS表达TNF-α的影响未显示出rmMIF对大鼠FLS表达TNF-α的影响:空白对照组和MIF组上清液中TNF-α浓度无统计学差异(P=0.408)。1.6 rmMIF对大鼠FLS表达IL-1β的影响未显示出rmMIF对大鼠FLS表达IL-1β的影响:经完全随机方差分析,各组上清液OPG浓度无统计学差异(P=0.549)。2 TG和GS对rmMIF诱导大鼠FLS增殖及表达骨破坏相关因子的影响2.1 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS增殖的影响TG可明显抑制rmMIF所致大鼠FLS增殖,GS对此无明显影响,未显示出TG和GS对此作用的配伍效应:与MIF组OD值相比,MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较低,MIF+GS组无统计学意义(P=0.236),MIF+TG组、MIF+GS+TG组有统计学意义(P=0.000,P=0.000);与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数较高,但无统计学意义(P=0.624)。2.2 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达OPG的影响TG有促进大鼠FLS表达OPG的作用,GS对此无明显作用,未显示出TG和GS的配伍效应:对细胞OPG标记指数进行统计分析,与空白组相比, MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较高,MIF+GS组无统计学意义(P=0.054),MIF+TG组、MIF+GS+TG组有统计学意义(P=0.000,P=0.000);与MIF组相比,MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较高,MIF+GS组无统计学意义(P=0.679),MIF+TG组、MIF+GS+TG组有统计学意义(P=0.000,P=0.000);与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数较高,但无统计学意义(P=0.545)。经完全随机方差分析,各组上清液OPG浓度无统计学差异(P=0.400)。2.3 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达RANKL的影响TG和GS均可抑制rmMIF诱导的大鼠FLS表达RANKL,二者有协同作用:对细胞RANKL标记指数进行统计分析,与MIF组相比, MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.003,P=0.000);无论是与MIF+GS组相比,还是与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数都较低,且有统计学意义(P=0.000,P=0.018)。对上清液中RANKL浓度进行统计学分析,与MIF组相比,MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.036,P=0.000,P=0.000);与MIF+GS组相比, MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.000);与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.034)。2.4 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达RANKL/OPG比值的影响TG可抑制rmMIF诱导的大鼠FLS表达的RANKL/OPG值升高,单独应用GS未显示有该作用,但对TG有协同作用:与MIF组的RANKL/OPG值相比,MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较低,MIF+GS组无统计学意义(P=0.059),MIF+TG组、MIF+GS+TG组有统计学意义(P=0.000,P=0.000);与MIF+GS组相比, MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.000);与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数较低,有统计学意义(P=0.023)。2.5 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达TNF-α的影响TG能抑制rmMIF诱导的大鼠FLS表达TNF-α,未显示GS有该作用,也未显示GS对TG有协同作用:与MIF组上清液中TNF-α浓度相比,MIF+GS组、MIF+TG组、MIF+GS+TG组均数较低,MIF+GS组无统计学意义(P=0.804),MIF+TG组、MIF+GS+TG组有统计学意义(P=0.018,P=0.039);与MIF+TG组相比,MIF+GS+TG组均数较高,但无统计学意义(P=0.729)。2.6 TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达IL-1β的影响未显示TG和GS对rmMIF诱导的大鼠FLS表达IL-1β有抑制作用:经方差分析,各组间IL-1β浓度无统计学差异(P=0.549)。结论:1 rmMIF可促进体外培养大鼠FLS增殖,上调大鼠FLS的RANKL表达和RANKL/OPG比值,提示促进滑膜细胞增殖及其骨破坏相关因子表达可能是MIF参与类风湿关节骨质破坏的重要病理机制。2 TG可抑制rmMIF诱导的大鼠FLS增殖;而GS无该作用,也未见其对TG抑制rmMIF诱导的大鼠FLS增殖的协同作用。抑制FLS增殖可能是TG治疗RA的机制之一。3 TG可抑制rmMIF诱导大鼠FLS分泌TNF-α、RANKL,可下调大鼠FLS的RANKL表达和RANKL/OPG比值,其作用强度与MTX相当;GS虽可抑制rmMIF诱导大鼠FLS分泌RANKL,但不能降低大鼠FLS上清液TNF-α、IL-1β水平及FLS表达的RANKL/OPG比值。4植物中药有效成分GS与TG配伍应用在抑制rmMIF上调大鼠FLS表达的RANKL水平、RANKL/OPG比值方面,均具有明显的协同作用,提示有效成分配伍是进一步提高RA临床疗效的重要方法和途径。