目的构建分枝杆菌噬菌体D29 gp10基因重组质粒,在E. coli BL21(DE3)中表达重组蛋白gp10,检测其单用及联用异烟肼的体外抗结核菌活性,为开发结核病新药提供新的方向。方法1.以分枝杆菌噬菌体D29基因组DNA为模板,PCR扩增gp10基因,克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-gp10,经双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白gp10。经SDS-PAGE鉴定后,采用镍柱纯化及透析复性目的蛋白。2.利用2倍微量稀释法原理,刃天青显色法检测重组蛋白gp10对结核分枝杆菌标准株H37Rv和临床分离耐多药株的最低抑菌浓度。利用7x7微量棋盘稀释法的原理,刃天青显色法观察重组蛋白gp10与异烟肼联用针对H37Rv的部分抑菌浓度指数。结果1.gp10基因经PCR扩增获得长1479bp的条带,重组质粒pET32a(+)-gp10经EcoR I和Not I双酶切获得长约5900和1479 bp的条带,测序结果与GenBank中查找的gp10基因序列完全一致,并表达相对分子质量75.2 KDa的融合蛋白。2.重组蛋白gp10对结核分枝杆菌H37Rv和临床分离耐多药株的最低抑菌浓度为256 μg/ml,与异烟肼联用对结核分枝杆菌H37Rv部分抑菌浓度指数为0.5。结论1.成功构建原核表达质粒pET32a(+)-gp10,并在E.coli BL21(DE3)中表达gp10蛋白。2.重组蛋白gp10单用对体外结核分枝杆菌标准株H37RV和临床分离耐多药株均表现出一定抗菌活性,联用异烟肼表现出协同抗菌效应。