中药是重要的天然药物，是在中医理论指导下用于治疗疾病的药物，而中医临床治病常用复方。每一味中药即是一个小的化学成分库，可见中药复方化学成分的复杂性。复杂的化学组成使得现代科学很难揭示中药复方的药效物质基础。与此同时，由于受到药用生物的个体差异性、天然矿物的不均一性等诸多因素影响，同种中药不同产地或不同采收季节所含成分差别很大。加之中药制剂工艺的粗糙性，中药的质量很难做到始终如一，进一步导致中药的疗效亦很难做到始终如一。药效物质基础不清楚，质量可控性低已成为制约中药发展的瓶颈问题。任何药物发挥药效都是通过与人体相互作用完成的。人体服用中药后，血液中一定存在源自中药的原型成分，或体内代谢及应激产物，这些成分可能是具有药理作用的活性成分，若对病证的主症产生显著治疗作用，则称为有效成分。因此，中药血清药物化学作为一种研究中药的新手段，已成为筛选中药药效物质基础十分有效的工具。另外，中药的药效往往是多成分和多靶点的协同作用结果，单一成分或单靶点效应的情况较为少见。而药代动力学研究在判断联合用药时不同药物之间的相互作用方面有着不可替代的作用，对中药复方组方原理研究意义重大。本研究以中医临床常用的元胡止痛方为研究对象，从其组方药物入手，运用血清药物化学分析和动物药代动力学等研究手段，旨在探讨和阐明元胡止痛方的主活性成分及其在体内代谢和组织分布规律，为揭示元胡止痛方的药效物质基础和组方原理奠定基础。1实验目的1.1建立元胡止痛方组方药物延胡索、白芷的有效组分延胡索总生物碱、白芷总香豆素在大鼠体内外成分分析方法，确证该方的主活性成分。1.2建立延胡索乙素、欧前胡素在大鼠血浆和组织中的分析方法，考察其主要药代动力学参数和组织分布特性。1.3初步阐释欧前胡素对延胡索乙素大鼠血浆药代动力学特性的影响。2实验方法2.1延胡索主活性成分研究2.1.1延胡索总生物碱提取和成分分析及其含量测定2.1.1.1延胡索总生物碱提取方法按照《中国药典》（2010年版一部）收载的“元胡止痛软胶囊”的制剂方法，制备延胡索药材提取物；然后，利用生物碱异溶于酸水而难溶于碱水的特点提取延胡索药材提取物中的总生物碱。2.1.1.2延胡索总生物碱成分分析方法采用HPLC法分析延胡索总生物碱提取物的化学成分。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna-C18column(250×4.6mm，5.0μm)；流动相：乙腈（A）、0.1%磷酸水溶液（三乙胺调至pH5.7，B）；梯度洗脱程序：0~15min，20%A；15~30min，20~25%A；30~50min，25~80%A；50~60min，80%A；柱温：30°C；流速：1mL/min；检测波长：280nm；进样量：10μL。2.1.2延胡索总生物碱提取物大鼠体内成分定性分析2.1.2.1大鼠血浆样品制备方法大鼠灌胃给予延胡索总生物碱提取物0.5h后，通过大鼠肝门静脉取血约1mL于肝素抗凝管中抗凝，3500r/min离心10min后即得血浆样品。2.1.2.2大鼠血浆样品预处理方法准确吸取大鼠血浆500μL于具塞玻璃离心管中，加入碱化试剂（NaOH；1mol/L）100μL，混匀；加入3mL氯仿萃取液，于涡旋混合器上混匀5min，3500r/min离心10min，重复两次，合并两次萃取液于洁净的玻璃离心管中，置于氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.1.2.3大鼠血浆样品分析方法采用HPLC法分析待测样品的化学成分。色谱条件：同“延胡索总生物碱成分分析方法”，进样量：20μL。2.2白芷主活性成分研究2.2.1白芷总香豆素提取和成分分析及其含量测定2.2.1.1白芷总香豆素提取方法按照《中国药典》（2010年版一部）收载的“元胡止痛软胶囊”的制剂方法，制备白芷药材提取物；然后，利用香豆素类物质易溶于乙酸乙酯的特性提取白芷药材提取物中的总香豆素。2.2.1.2白芷总香豆素成分分析方法采用HPLC法分析白芷总香豆素提取物的化学成分。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna-C18column (250×4.6mm，5.0μm)；流动相：乙腈（A）、0.1%磷酸水溶液（三乙胺调至pH6.0，B）；梯度洗脱程序：0~5min，4%A；5~30min，4~28%A；30~55min，28~31%A；55~80min，31~70%A；80~90min，70~80A；90~95min，80%A；柱温：40°C；流速：1mL/min；检测波长：300nm，进样量：10μL。2.2.2白芷总香豆素提取物大鼠体内成分定性分析2.2.2.1大鼠血浆样品制备方法大鼠灌胃白芷总香豆素提取物2.5h后，通过大鼠肝门静脉取血约1mL于肝素抗凝管中抗凝，3500r/min离心10min后即得血浆样品。2.2.2.2大鼠血浆样品预处理方法准确吸取大鼠血浆500μL于具塞玻璃离心管中，加入3mL乙酸乙酯萃取液，于涡旋混合器上混匀5min，3500r/min离心10min，重复两次，合并两次萃取液于洁净的玻璃离心管中，置于氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.2.2.3大鼠血浆样品分析方法采用HPLC法分析待测样品的化学成分。色谱条件：同“白芷总香豆素成分分析方法”，进样量：20μL。2.3延胡索乙素大鼠血浆药代动力学研究2.3.1大鼠血浆样品制备方法大鼠灌胃延胡索乙素（tetrahydropalmatine；TDE）后0，0.083，0.17，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12h，通过大鼠眼底静脉丛取血约0.4mL于肝素抗凝管中抗凝，3500r/min离心10min后即得血浆样品。2.3.2大鼠血浆样品预处理方法准确吸取大鼠血浆200μL于具塞玻璃离心管中，分别加入10μL内标液（延胡索甲素corydaline；CDE），50μL碱化试剂（NaOH；1mol/L）混匀；加入1.5mL正己烷-异丙醇（95:5）萃取液后，于涡旋混合器上混匀5min，3500r/min离心10min，取萃取液置于洁净的玻璃离心管中，置于氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.3.3大鼠血浆样品分析方法采用内标法测定大鼠含药血浆中TDE的含量。色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18column (250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸（三乙胺调至PH6.2）（60:40）；柱温：30°C；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：280nm。2.4欧前胡素大鼠血浆药代动力学研究2.4.1大鼠血浆样品制备方法大鼠灌胃欧前胡素（imperatorin，IMP）后0，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，10h，通过大鼠眼底静脉丛取血约0.4mL于肝素抗凝管中抗凝，3500r/min离心10min后即得血浆样品。2.4.2大鼠血浆样品预处理方法准确吸取大鼠血浆200μL于具塞玻璃离心管中，加入10μL内标液（异欧前胡素isoimperatorin；ISO）混匀；加入1.5mL乙酸乙酯-石油醚（1:1）萃取液，置于涡旋混合器上混匀5min，3500r/min离心10min，取萃取液于洁净的玻璃离心管中，置于氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.4.3大鼠血浆样品分析方法采用内标法测定大鼠含药血浆中IMP的含量。色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18column (250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：乙腈-水（60:40）；柱温：25°C；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：300nm。2.5欧前胡素大鼠体内组织分布研究2.5.1大鼠组织样品制备方法大鼠灌胃IMP后0.5，1.5，2.5，4，6，8h，断头处死并迅速取出脑、心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢等组织；心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢用少量生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后置于-80°C冰箱储存；将脑组织清洗干净后立即置于冰盘上，使用眼科镊将脑组织分离为大脑皮层、小脑、脑干、间脑、纹状体、海马等部分，置于-80°C冰箱储存。2.5.2大鼠组织样品预处理方法大脑皮层、小脑、脑干、间脑、心、肝、脾、肺、肾称重后，以1:15比例加入生理盐水；纹状体、海马、子宫、卵巢称重后，以1:30比例加入生理盐水；将各组织样品置于冰浴条件下，用组织匀浆器匀浆；然后将获得的组织匀浆置于离心机中，12000r/min离心10min后取上清液500μL于洁净玻璃离心管中；加入20μL内标液（ISO）和3mL乙酸乙酯-石油醚（1:1）萃取液，涡旋混匀5min，3500r/min离心10min，取萃取液于洁净的玻璃离心管中，置于氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.5.3大鼠组织样品分析方法同IMP大鼠血浆样品分析方法。2.6欧前胡素对延胡索乙素大鼠血浆药代动力学特性影响研究过程同TDE大鼠血浆药代动力学研究。3实验结果3.1延胡索中主活性成分研究建立的HPLC法能够同时检测延胡索总生物碱提取物中多种物质，其中定量分析了10种（原阿片碱：PTP；别隐品碱：AYE；黄连碱：CTE；海罂粟碱：GUE；巴马汀：PME；小檗碱：BRE；去氢紫堇碱：DDE；TDE；四氢小檗碱：THE；CDE），其中DDE、TDE、CDE含量较高；这些物质中，大鼠口服延胡索总生物碱提取物后检测到6种（PTP、AYE、GUE、PME、TDE、CDE），但并未检测到延胡索总生物碱提取物中含量最高的DDE，而TDE的止痛活性优于CDE，因此本研究初步认为TDE为延胡索的主活性成分。3.2白芷中主活性成分研究建立的HPLC法能够同时检测白芷总香豆素中多种物质，其中定量分析了6种（花椒毒酚：XTT；花椒毒素：XTX；佛手苷内酯：BAT；异茴芹内酯：IPN；IMP；ISO），其中IMP含量最高；这些物质中，大鼠口服白芷总香豆素提取物后全被检测到，因此本研究初步认为IMP为白芷的主活性成分。3.3延胡索乙素大鼠血浆药代动力学研究TDE代谢模型为二室模型，其主要药动学参数：AUC(0-t)：6.44±1.69mg/L/h； AUC(0-∞)：8.62±3.03mg/L/h；T1/2z：6.92±4.35h；Tmax：0.63±0.23h；Cmax：2.29±0.82mg/L。3.4欧前胡素大鼠血浆药代动力学研究IMP代谢模型为二室模型，其主要药动学参数：AUC(0-t)：6.52±2.25mg/L/h；AUC(0-∞)：6.79±2.03mg/L/h；T1/2z：1.75±1.39h；Tmax：2.5h；Cmax：1.45±0.49mg/L。3.5欧前胡素大鼠组织分布研究脑组织各区域均含有IMP，其中纹状体的含量最高（P＜0.05）；心、肝、脾、肺、肾、子宫和卵巢中均含有IMP，其中肝组织中含量最高（P＜0.01）。3.6欧前胡素对延胡索乙素大鼠血浆药代动力学特征影响研究TDE配伍IMP后其主要药动学参数为AUC(0-t)：15.55±3.22mg/L/h；AUC(0-∞)：18.31±4.40mg/L/h；T1/2z：4.41±1.17h；Tmax：0.5h；Cmax：3.51±0.88mg/L。与TDE单独用药相比，AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax均有提高（P＜0.01）。4研究结论4.1建立的分析方法适用于延胡索总生物碱提取物、白芷总香豆素提取物大鼠体内、外成分分析。初步确定TDE和IMP分别为延胡索和白芷的主活性成分，为元胡止痛方有效成分进一步研究奠定了基础。4.2建立的分析方法适用于TDE、IMP大鼠体内药代动力学研究，结果显示TDE、IMP代谢模型均为二室模型，TDE和IMP均在大鼠纹状体分布最高，说明两者极有可能在纹状体协同发挥作用。初步揭示IMP能够提高TDE进入大鼠体内的含量，为元胡止痛方有效成分间药动学影响进一步研究奠定了基础。4.3首次以TDE代表延胡索、IMP代表白芷，从药物分子层面部分阐释了元胡止痛方的组方合理性。