论文部分内容阅读
在过去的二十年中,我国养禽业经历了快速发展的阶段,规模化、集约化程度进一步提高。1996年,H5N1亚型高致病性禽流感病毒(High Pathogen Avian Influenza Virus, HPAIV)首次出现于广东省。2003年,H5N1亚型HPAIV在亚洲再次暴发,严重影响了养禽业的发展。目前,我国防治HPAIV主要通过大规模疫苗接种以及对病禽进行扑杀和隔离,该策略已经成功地降低了我国HPAIV暴发次数。然而,H5N1亚型AIV一直存在于我国的家禽群中,并给人类健康构成了威胁。因此,我们必须对家禽中的H5N1亚型AIV的流行和基因变异情况进行调查研究。2011年-2012年间,本试验从我国某省的7个地区的家禽交易市场和养殖场采集棉拭子和组织样品共2110份,并运用RT-PCR方法对样品进行H5亚型AIV检测,检测结果表明总的阳性率为7.25%。其中,鸭的阳性率较高,约为14.83%,其次为鸡(3.32%)和鸽子(2.50%),鹌鹑和鹅的临床样品全部为阴性。再者,我们分析了AIV感染率与季节的关系。与其他季节相比,在春季和秋季采集的样品中AIV阳性率较高,分别为7.50%和7.96%。另外,我们对某省不同地区H5亚型AIV的流行情况也进行了分析。与其它地区相比,地区1和3的样品中H5亚型AIV阳性率较高。同时也分析了样品来源的场点阳性率,家禽交易市场场点阳性率高于养殖场场点阳性率。为全面了解某地H5亚型禽流感病毒的基因变异情况,本试验从检测的阳性样品中选取26份H5亚型AIV阳性样品,其中21份样品进行HA基因克隆、5份样品进行全基因克隆,利用禽流感病毒通用引物成功扩增禽流感病毒全基因组和HA基因全长序列,并进行测序。本试验从NCBI下载24个国内外H5N1亚型AIV参考株序列,并运用Lasergene DNAstar (version7.1)和DNAMAN (version6.0)软件对测序结果与参考毒株进行核苷酸序列分析。分子发育树使用邻接的方法通过MEGA5.1软件构建。本试验对AIV各基因片段的核苷酸同源性分析表明：26株禽流感的HA基因核苷酸序列同源性在91.2%-99.9%之间；5株禽流感病毒NA、NS、M、NP、PA、PB1和PB2基因的核苷酸同源性分别为96.9%-99.8%、96.3%-100.0%、98.6%-99.8%、96.5%-99.9%、93.1%-99.8%、97.8%-99.8%、98.7%-99.9%。26株AIV的HA蛋白的裂解位点(R-R-R-K/-/R-K-R)符合高致病性禽流感的分子生物学特征。全部5株禽流感病毒NA基因茎部都具有20个氨基酸的缺失,均含有3个潜在的糖基化位点。NS蛋白氨基酸序列第81-85位有5个氨基酸的缺失。禽流感全基因组遗传进化分析表明：该5株禽流感病毒亲缘关系较近。该5株病毒的HA基因与A/Chicken/Jiangsu/K0402/2010(H5N1)处于同一进化分支,核苷酸同源性最高；M、NA、NP、NS和PB1基因与A/Duck/Zhejiang/213/2011(H5N1)亲缘性较近；余下的PA和PB2基因分别与A/muscovyduck/Vietnam/LBM66/2011(H5N1)、 A/muscovyduck/Vietnam/LBM66/2011(H5N1)亲缘关系最近,说明这5株病毒可能为重组病毒。与早期毒株比较,本试验鉴定的26株AIV HA基因存在较大变异。但是,HA基因的宿主结合位点无变异,表明AIV对宿主感染谱未发生变化。2001和2004年的分离株与2008-2012年间分离株相比,HA基因的裂解位点存在突变(K-R)或缺失。该地区主要流行的AIV大约以每年1%的幅度发生着变异。因而,为了有效预防和控制AIV,应选择与目前流行性相近的毒株作为疫苗毒株。