心脑血管疾病一直是危害人类健康的“头号杀手”,而中国作为人口老龄化大国,缺血性脑中风的发病率居高不下,严重影响国民健康。自1994年,缺血性脑中风已成为中国大城市中第一位致死性疾病,每10万人口中约有429~620人患此病,每年每10万人口中约有116~142例死亡。脑对缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差,是最容易发生缺血再灌注损伤的器官之一,其功能障碍对人的精神、情感、行为、意识以及几乎所有的脏器功能均会产生不同程度的影响。脑缺血损伤后的神经炎症往往贯穿缺血再灌注损伤病理发展的全过程,强烈的神经炎症反应造成的脑继发性损伤是目前临床上非常棘手的问题,因而抑制脑内神经炎症将会为脑中风患者的治疗和预后带来曙光。小胶质细胞作为脑内免疫细胞的代表,其在神经炎症中的功能变化受到人们的广泛关注。在缺血再灌注损伤的不同时期,小胶质细胞的功能持续发生变化。经典激活状态(M1 phenotype)的小胶质细胞在炎症早期释放大量炎症因子及氧自由基等有害物质,破坏神经元结构的完整性和功能的稳定性;而选择性激活状态(M2 phenotype)的小胶质细胞则在炎症晚期分泌一些神经营养物质,清除坏死或凋亡的神经元碎片,促进组织胶质瘢痕的形成以及营养神经元。因而调控小胶质细胞的功能活化状态使其趋利避害,减轻脑内神经炎症,控制疾病的发生发展,将是防治缺血后神经损伤的新目标。II型髓样细胞激发受体(TREM2)是高表达于小胶质细胞上的一种免疫球蛋白样受体,它在自身免疫及炎症过程中发挥“负性调节”的有益作用。那么TREM2是不是调控小胶质细胞活化状态转变的关键靶点?调控TREM2的表达能否改善脑缺血损伤后的神经功能?针对这些科学问题,我们通过体内、体外实验证实了上调TREM2的表达可促使小胶质细胞由M1型向M2型转变减轻神经炎症,改善缺血后神经功能,初步阐明TREM2是调控小胶质细胞活化状态的重要信号分子,有助于缺血性脑中风新型治疗手段和药物的研发。实验一:不同功能活化状态的小胶质细胞中TREM2的表达【目的】观察TREM2在M1和M2两种不同功能活化状态小胶质细胞中的表达,初步明确其与M1和M2活化状态的关系。【方法】采用LPS/IFN-γ定向诱导原代小胶质细胞向M1型转化,L-4/IL-13定向诱导原代小胶质细胞向M2型转化,应用Western Blot和免疫荧光染色方法检测细胞内M1标记物i NOS、M2标记物Arg-1以及TREM2的表达。【结果】LPS/IFN-γ组i NOS表达较control组多(P<0.05),而IL-4/IL-13组Arg-1表达较control组多(P<0.05),初步将小胶质细胞按功能状态区分开来,进而发现TREM2在IL-4/IL-13组表达升高,且与control组相比有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光双标染色结果与Western Blot近乎一致。【结论】TREM2在M2型小胶质细胞上表达升高,而在M1型小胶质细胞上表达降低。实验二:脑缺血损伤后小胶质细胞功能活化状态的变化及TREM2的表达【目的】观察脑缺血后再灌注不同时间点小胶质细胞M1型和M2型标记物的变化及TREM2的表达情况。【方法】将27只SPF级雄性C57BL/6小鼠分为Sham组和MCAO组,其中MCAO组小鼠再次随机分为4组,即构建MCAO动物模型后,于再灌注后的6h,24h,3d和7d分别取缺血半暗带脑组织(n=6),应用Western Blot和免疫荧光染色方法检测并观察梗死同侧区半暗带脑组织中i NOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表达。【结果】再灌注后6h,i NOS的表达最高(P<0.01),同样在6h这一时间点也观察到IL-6的表达增加(P<0.001),M1型标记物i NOS、IL-6在6h、24h均较对照组升高,M2型小标记物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表达最高(P<0.001)。TREM2的表达随缺血再灌注时间的延长而逐渐增高,在3d表达最高(P<0.001)。【结论】脑缺血损伤后早期以M1型小胶质细胞为主,脑缺血损伤后晚期以M2型小胶质细胞为主,TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2过渡期表达最高。实验三:下调TREM2的表达对脑缺血损伤的影响【目的】探讨下调TREM2的表达后对脑梗死容积、神经行为学评分、神经元凋亡的影响。【方法】雄性C57BL/6小鼠24只分为以下3组:MCAO组、si RNA组、scr RNA组,其中MCAO组处理方法同前;si RNA组、scr RNA组:侧脑室注射TREM2-si RNA、control si RNA,72 h后构建MCAO模型,大脑中动脉缺血1 h后再灌注。缺血再灌注后3d取脑组织,通过TTC染色、神经行为学评分(Longa评分)、TUNEL染色的方法对脑功能进行评估。【结果】TUNEL染色结果显示TREM2-si RNA组与MCAO组相比,神经元凋亡数目明显增多(P<0.05),但TREM2-si RNA组的小鼠脑梗死容积和神经行为学评分与MCAO组无统计学差异。【结论】下调TREM2的表达后加重神经元的凋亡。实验四:上调TREM2的表达发挥脑保护作用【目的】探讨上调TREM2的表达后对脑梗死容积、神经行为学评分、神经元凋亡的影响。【方法】将32只雄性C57BL/6小鼠分为4组:MCAO组、Hsp60 2.5μg组、Hsp603.75μg组、Hsp60 5μg组,其中MCAO组处理方法同前;Hsp60 2.5μg组、Hsp603.75μg组、Hsp60 5μg组:腹腔注射Hsp60药物1h后开始构建MCAO模型;同样,将雄性C57BL/6小鼠24只分为Sham组、MCAO组、LV+MCAO组,其中LV+MCAO组:侧脑室注射TREM2-过表达慢病毒,于10d后构建MCAO模型,大脑中动脉缺血1 h后再灌,再灌注后3d取材,通过TTC染色、神经行为学评分(Longa评分)、TUNEL染色的方法评估脑功能。【结果】Hsp60 5μg组与MCAO组相比,神经行为学评分以及脑梗死容积减少均有统计学意义(P<0.001),TUNEL染色表明Hsp60 3.75μg组、Hsp60 5μg组与MCAO组相比,凋亡细胞数量有所减少(P<0.01)。LV+MCAO组与MCAO组相比,脑梗死容积有所减少(P<0.05),M1标记物i NOS表达降低(P<0.01)而M2标记物Arg-1表达升高(P<0.001)。【结论】Hsp60激活TREM2的表达,能够改善缺血再灌注后神经功能,从而发挥脑保护作用;TREM2-过表达慢病毒上调TREM2的表达,同样发挥脑保护作用。实验五:慢病毒调控TREM2的表达对氧糖剥夺模型后小胶质细胞功能活化状态的影响【目的】进一步在细胞实验中验证调控TREM2的表达能够改变缺血后小胶质细胞功能活化状态。【方法】将N9小胶质细胞分为以下三组,control-vector组、TREM2-vector组、TREM2-si RNA组,慢病毒转染3d后将细胞给予氧糖剥夺模型处理4h,随后复糖复氧24h,接着收集细胞并提取细胞蛋白用Western Blot的方法检测i NOS、IL-6、BDNF、Arg-1的表达情况。【结果】TREM2-vector组与control-vector组相比,M2标记物BDNF、Arg-1的表达均较对照组升高,且存在统计学差异(P<0.05);TREM2-si RNA组i NOS、IL-6表达较control-vector组增加高(P<0.001)。【结论】上调TREM2的表达促进小胶质细胞向M2型转变,而下调TREM2表达促进小胶质细胞向M1型转变。