维生素K2是一类侧链长度不同的异戊烯基化甲萘醌产品的总称,属于衍生脂质。其中四烯甲萘醌(MK-4)在促进凝血和防治骨质疏松症方面具有良好的效果,在临床上具有较高的应用价值。大肠杆菌和毕赤酵母作为两种成熟高效的蛋白表达系统,已被成功地应用于多种异源蛋白的表达。本课题组已经在大肠杆菌中成功实现了 MK-1从无到有的生物合成,而侧链长度更长的MK-4的生物制造将是我们下一步要实现的目标。毕赤酵母表达系统具有繁殖迅速、易于高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后加工修饰,易获得可溶性活性重组蛋白等优点,尽管在毕赤酵母中尚未发现甲萘醌的生物合成途径,但这也可以在一定程度上避免复杂的分支途径和反馈调节机制对重构路径造成的不利影响。因此,为实现MK-4的高效生物制备,本研究运用合成生物学理念,基于多维度的信息整合,将高效的酶和生物合成途径整合到大肠杆菌和毕赤酵母底盘细胞中,构建以廉价的VK1或VK3为原料的MK-4高效生物制备的细胞工厂,并通过分析其优缺点以确定最佳的表达系统。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盘细胞种类,为VK2等异戊烯基化产品的生物合成途径构建与优化提供了新的思路,具有重要的理论和应用价值。论文首先从物质和能量代谢角度出发在E.coli中重构MK-4代谢途径,通过MBP促溶标签实现古细菌来源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基础上通过敲除pgi基因,调控EMP、PPP和EDP三条葡萄糖分解代谢途径的分配,强化胞内还原力NADPH的合成,使重组菌株胞内的MK-4含量达到0.78 mg/L。由于其合成能力未达预期,同时考虑到菌株稳定性和生物安全性等问题,将在毕赤酵母中开展后续的研究工作。通过对KEGG等数据库信息的整合,利用生物合成途径设计软件BioSynther,以VK3和IPP作为底物对MK-4的生物合成途径进行理性设计,并确定催化萘醌骨架与异戊烯基侧链聚合反应的关键酶HsUBIAD1。为了制定更好的蛋白表达策略,对该蛋白的理化性质、结构以及催化活性中心等进行了相关的生物信息学分析。利用生物信息学分析的结果,构建产HsUBIAD1蛋白的重组毕赤酵母,并结合多重筛选机制,获得高产重组毕赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的摇瓶水平上,对筛选出的高产菌株GGU-23的基本发酵过程参数进行优化,并确定了24℃,初始pH 7.0,培养36h的摇瓶发酵工艺,优化后的GGU-23菌株的生物量达到31.0 g/L,较优化前提高了 6.9%,蛋白表达量提高了 4.8倍。为了表征HsUBIAD1的酶学性质,利用Ni-NTA亲和层析柱和重力型去盐柱从重组GGU-23菌株中获得纯化的HsUBIAD1蛋白,并进行初步的动力学分析,确定了体外的最佳酶促反应体系和条件:初始pH 7.0,31℃,当Mg2+参与的条件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3异戊烯基化反应的活性最高,较优化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通过与蛋白的活性中心的关键氨基酸发生相互作用,改变其内部构象,使异戊烯基侧链与活性中心氨基酸残基的结合能力增强,进而促进酶促反应的进行。在GGU-23菌株全细胞催化的研究中,发现其具有催化外源VK1和VK3异戊烯基化反应合成MK-4的能力,当以VK3作为全细胞催化体系的底物时,胞内MK-4的含量达到2.03 mg/L,实现了初代重组毕赤酵母菌株从无到有合成MK-4的突破。为了获得新一代的细胞工厂,需要对初代细胞工厂的细胞性能进行优化,提高其MK-4的合成能力。通过构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体,将外源侧链合成途径的关键酶SaGGPPS整合到产MK-4的初代毕赤酵母细胞中,强化侧链合成前体GGPP的供给,使全细胞催化体系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通过融合表达策略,将SaGGPPS与其上游的PpIDI蛋白进行融合表达,侧链合成途径得到了进一步的优化,MK-4的含量达到5.86 mg/L,较之前又提高了78.1%。实现了毕赤酵母菌株(GGU-GrIG)目标产物合成性能从低到高的优化。为了进一步挖掘优化后的毕赤酵母细胞工厂的应用潜力,继续对工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全细胞催化工艺进行优化,摸索出最合适的工艺参数,即在30℃,250 rpm的条件下,从催化反应开始起每间隔6 h,向催化体系中添加40 mg/L VK3溶液,连续培养18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌经过优化,MK-4产量达到7.55 mg/L,较优化前提高了 28.8%,表现出良好的稳定性和应用潜力。