随着养禽业集约化程度的提高,禽呼吸系统病毒性疾病的发病率逐渐上升,而且由单一病原感染向多种病原混合感染发展,临床上难以鉴别诊断,往往延误防治时机,给养禽业带来巨大的经济损失。禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)是引起禽类呼吸系统疾病的重要病毒性病原,临床发病率高,难以鉴别诊断,因此建立一种既快速又准确的检测方法,成为国内外兽医工作者研究的方向。液相芯片技术作为一种新型的高通量检测技术,具有操作简便、准确性高、高通量检测等常规方法无法比拟的优点,适合对多种病原的快速检测。本试验即从单重液相芯片和多重液相芯片两方面研究检测AIV H5、H7、H9三种亚型,NDV、IBV、ILTV6种病毒核酸的液相芯片方法,旨在为禽类呼吸系统病毒性疾病病原的快速而准确的检测奠定基础。从GenBank中收集AIV的H5、H7、H9毒株的HA基因序列,NDV的F基因序列,IBV的N基因序列和ILTV的TK基因序列,分别用DNA MAN、DNA star、Primer5.0和Primer Express3.0等生物软件进行多序列比对分析,筛选出保守区,设计各个病毒的引物和探针。将设计好的探针引物进行标记后与荧光编码微球偶联。将不对称PCR/RT-PCR扩增好的PCR产物与偶联有微球的探针杂交,应用Bio-Plex200系统分析读取MFI值,根据判定标准进行判定,并进行了特异性、敏感性、稳定性试验以及临床样品的检测。通过对杂交温度、杂交时间等反应条件的优化首先建立了AIV H5、H7、H9亚型,NDV、IBV、ILTV6种病毒核酸单重液相芯片的检测方法。结果表明,AIV H5、H7、H9亚型,NDV、IBV、ILTV6种病毒核酸的最低检测浓度分别为8.50×10-4ng/μL、2.87×10-4ng/μL、2.07×10-4ng/μL、2.61×10-4-ng/μL、2.34×10-3ng/μL、2.05×10-3ng/μL与相应病毒RT-PCR/PCR检测方法相比,敏感性提高10-100倍；每种芯片得到的MFI值都较高,且只能特异的检测出各自的病毒核酸,而对其它病毒的检测结果均为阴性；对临床50份已知样品检测的结果,相符率为100%。结果表明,本实验所建立的检测AIV的H5、H7、H9三个亚型、NDV、IBV、ILTV6种病毒核酸的单重液相芯片技术敏感性、特异性和稳定性均较好。在此基础建立了同时检测AIV H5、H7、H9, NDV、IBV、ILTV6种病毒核酸的多重液相芯片检测方法。多重液相芯片的检测方法中各个病毒探针对相应病毒核酸检测的MFI值较高,与其他病毒之间没有交叉反应,重复性好；每种病原核酸的最低检测浓度分别为5.44×10-4ng/μL、1.84×10-3ng/μL、2.65×104ng/μL、8.35×10-3ng/μLng/ul、1.50×10-3ng/μL、6.56×10-3ng/μL,灵敏度比相应PCR/RT-PCR方法提高了5-125倍。应用建立的液相芯片体系对50份已知病毒样品进行检测,结果符合率为100%。本试验成功地建立了检测AIV H5、H7、H9、NDV、IBV和ILTV6种病毒核酸的单重液相芯片和多重液相芯片的方法,为禽呼吸系统病毒性疾病的快速、高通量鉴别诊断搭建了新的技术平台,也为检测其他病毒性疾病病原的研究提供了新的思路。