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背景Tim-3起初发现表达于活化的CD4+Th1,Th17,CD8+Tc1细胞上,并通过负性调控上述细胞的功能维持免疫耐受。然而,随后的数据显示Tim-3在巨噬细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞等参与天然免疫应答的细胞上也有表达,并可调节天然免疫反应。Tim-3在天然免疫及获得性免疫中的重要作用使其在许多免疫相关性疾病的发病机制中具有一定的影响力。在适应性免疫方面,已有多项研究发现Tim-3在许多疾病中表达异常。多发性硬化症患者T细胞上Tim-3的表达显著降低,系统性红斑狼疮患者中有狼疮肾炎的Tim-3的m RNA水平明显低于那些没有狼疮肾炎的。这些发现表明Tim-3通路可能在自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用。另外Tim-3也与多种肿瘤疾病相关。在大量的前列腺样本中发现,从前列腺上皮内瘤到局部前列腺癌再到转移性前列腺癌中CD4+T细胞和CD8+T细胞上Tim-3的水平不断升高,与此相似在宫颈癌及胃癌患者体内高水平的Tim-3均提示了预后较差。另外,Tim-3与感染的关系也有不少的研究。研究发现HIV-1感染个体中T细胞上Tim-3的表达水平对与HIV-1病毒载量成正相关;流感病毒感染后肺部的T细胞上Tim-3的表达增加,类似现象还有很多,如慢性丙型肝炎病毒感染和HSV感染后T细胞也发生Tim-3的表达上调。在Tim-3与疾病的研究中发现其也与天然免疫细胞有关。研究发现在小鼠免疫诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎中,在中枢神经系统浸润的CD11b+单核细胞和固有小神经胶质细胞上Tim-3上调。ITP患者外周血和脾脏中的单核细胞上Tim-3的m RNA表达与对照组相比显著降低。但相对于获得性免疫,疾病中Tim-3在天然免疫细胞上的表达情况尚缺乏深入研究。机制也需要进一步的探讨。基于Tim-3在多种疾病中表达失常,所以针对Tim-3采取的疾病干预策略也逐渐受到关注。例如使用Tim-3的配体galectin-9治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎,可选择地减少IFN-γ分泌细胞的数量,使疾病得到改善,暗示了Tim-3激动性抗体对自身免疫病可能有治疗作用。Chiba等人的研究表明,在皮下结肠肿瘤模型中,使用抗Tim-3抗体能增强化疗药物CDDP的抗肿瘤效果。Dardalhon和同事发现抗Tim-3单抗抑制皮下移植瘤EL4淋巴瘤的生长。R.Brad等人使用重组可溶性Tim-3阻断Tim-3通路后HIV-1特异性T细胞的功能增强,抗Tim-3抗体也得到了同样的结果。Lucy等的研究表明使用抗Tim-3抗体可以促进CD4+和CD8+HCV特异性T细胞的增殖及细胞因子的分泌。以上充分证明了Tim-3在自身免疫病、肿瘤及慢性感染性疾病中的重要作用,及干预Tim-3通路后可影响这些疾病的进程。但目前尚没有成熟的干预药物问世。因此,我们制备了Tim-3融合蛋白以便深入研究Tim-3干预对疾病的影响及对天然免疫细胞的调控机制。目的制备人、鼠Tim-3融合蛋白,验证其体外、体内活性,初步探讨Tim-3干预后对天然免疫机制的影响。方法1.原核表达Tim-3融合蛋白并进行纯化。2.体外评价Tim-3融合蛋白的生物学活性:分别阻断巨噬细胞系RAW264.7及U937,肿瘤患者PBMC及肿瘤患者外周血细胞,检测炎症性因子水平的变化,验证体外活性。3.对Tim-3融合蛋白的体内活性进行评价a.首先建立Tim-3的转基因小鼠的百草枯中毒模型证明Tim-3可减轻PQ中毒引起的炎症损伤,然后使用Tim-3融合蛋白进行干预观察其是否加重炎症反应;b.建立CT26结肠癌小鼠移植瘤模型,使用Tim-3融合蛋白进行干预,观察其对肿瘤生长的影响,检测对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响。4.建立更加符合肠道肿瘤生理状态的CAC模型并使用巨噬细胞系,初步探索Tim-3影响巨噬细胞极化的机制。结果1.我们成功制备了人、鼠Tim-3融合蛋白。2.对Tim-3融合蛋白进行体外活性评价,发现其能竞争性阻断巨噬细胞等细胞表面Tim-3与其配体的相互作用,增加IL-6、IL-8的分泌,且人、鼠Tim-3融合蛋白之间具有交叉反应性;对肿瘤患者PBMC及肿瘤患者外周血细胞上Tim-3的信号均发挥阻断作用。3a.PQ中毒后Tim3-转基因小鼠较野生型小鼠表现出较轻的炎性损伤,提示Tim-3是一重要的免疫反应负性调控蛋白,而用Tim-3融合蛋白阻断Tim-3信号后,PQ中毒小鼠的免疫反应及炎症损伤进一步加重。3b.Tim-3融合蛋白可明显抑制移植瘤的增长,且干预后诱导肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)向抗肿瘤的M1方向极化。4.机制研究发现Tim-3抑制细胞内Stat1磷酸化水平,同时促进表观遗传调控相关的KDM6a的表达,初步解释了Tim-3调控巨噬细胞极化的分子机制。结论1.制备的Tim-3融合蛋白在体内、外均有生物学活性。2.Tim-3高表达导致PQ中毒小鼠炎症反应减轻,表明Tim-3在维持炎症反应中具有重要的调控功能;Tim-3融合蛋白在PQ中毒小鼠体内阻断Tim-3通路进一步加重了免疫炎症反应,该结果提示我们制备的融合蛋白具有显著的免疫及炎症反应调控功能。3.Tim-3融合蛋白干预可以在体内抑制肠肿瘤的生长,诱导肠道巨噬细胞向抗肿瘤的M1方向的极化。4.从胞内信号转导和表观遗传修饰角度初步探讨了Tim-3影响炎症反应的机制,初步发现Tim-3可能通过抑制Stat1的磷酸化、上调KDM6a的表达水平来调控巨噬细胞极化过程。