论文部分内容阅读
华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng.)是我国一个特有种,为国家一类珍稀濒危植物和急需保护的农作物野生亲缘物种;具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、早熟、优质、矮杆、抗病等特点。本研究通过细胞学、原位杂交和PAGE电泳鉴定出携带华山新麦草的HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白基因的华山新麦草1Ns二体异附加系,并对该异附加系进行了农艺性状、品质特性和SSR标记研究,同时对华山新麦草的HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白基因进行了克隆和序列分析。主要结果如下:1、在小麦与华山新麦草的杂交和回交后代中,选育出小麦-华山新麦草二体异附加系H9021-28-5。对其进行细胞遗传学研究表明:H9021-28-5的染色体数目及构型为2n=44=22Ⅱ,遗传基本稳定;荧光原位杂交表明,H9021-28-5包含42条小麦染色体和1对华山新麦草染色体;种子贮藏蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE和A-PAGE)表明:H9021-28-5携带有华山新麦草的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)、低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)和醇溶蛋白(Gliadin)基因。说明,H9021-28-5为普通小麦-华山新麦草的1Ns二体异附加系,且华山新麦草的HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白(Gliadin)基因已导入普通小麦。2、对异附加系H9021-28-5的农艺性状调查表明,附加华山新麦草1Ns染色体后,小麦株高、穗长、小穗数、穗粒数等性状显著降低,小麦籽粒的长度和粒径等性状显著升高,条锈病抗性增强。面粉加工品质分析表明,含有华山新麦草HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白基因的异附加系比小麦亲本7182,在沉降值、蛋白质含量、面团形成时间、稳定时间、拉伸曲线面积、拉伸阻力和延伸度等品质指标上得到明显提高。矿物质元素含量测定表明,华山新麦草的多种矿物质元素含量均比普通小麦高,异附加系H9021-28-5的钙、磷、镁、锌等11种元素的含量得到明显提高。SSR和EST-SSR标记分析表明,在278对SSR引物中有Xgdm19、Xgdm43、Xgwm213和Xgwm497等4对引物,在49对EST-SSR引物中有Ksum11、Ksum19、Ksum117、Ksum220、Ksum255和Swes145共6对引物,在华山新麦草和异附加系H9021-28-5中均可扩增出特异条带,这些引物可初步用来检测华山新麦草的1Ns染色体。3、采用PCR方法,从华山新麦草基因组中分离到了华山新麦草HMW-GS的启动子基因序列。对该启动子基因HGp-Ns-1(GQ139524)序列分析显示,该序列在起始位点上游,从5’至3’侧翼方向,依次有E-box,N-box,G-box,HMW谷蛋白特异38bp增强子序列和TATA-box等HMW-GS特异表达的顺式或反式作用调控元件;系统进化分析表明,该启动子序列(HGp-Ns-1)与拟鹅观草Ps. spicata的y-型HMW-GS启动子基因具有相对较近的亲缘关系。4、通过PCR方法,从华山新麦草基因组中分离克隆到了4条LMW-GS基因序列。序列结构分析显示,这4条序列的编码区依次都有信号肽、N-末端保守区、中间重复区、C-末端I区、C-末端II区和C-末端保守区等特征区域,都含有8个半胱氨酸残基(C),N-末端起始氨基酸序列为METSRIPS-或METSRIPG-,说明,这4条序列都为华山新麦草的LMW-m型LMW-GS基因。序列FJ600493(LG-Ns-1)、FJ600494(LG-Ns-2)和GQ223386(LG-Ns-3)在编码区出现提前终止密码子,可能为假基因。序列GQ139528(LG-Ns-4)包含LMW-GS的基因完整编码区和部分启动子序列,该启动子序列的5’侧翼端,从5’到3’方向,依次有保守胚乳框、E-box、F-box、CAAT box、TATA框等LMW-GS基因的特异表达调控元件。这4条序列的系统进化分析表明,它们与纤毛鹅观草E. ciliaris的LMW-GS基因具有相对较近的亲缘关系。5、采用PCR方法,从华山新麦草基因组中分离获得了4条α-型和1条ω-型醇溶蛋白基因序列。对4条α-醇溶蛋白基因序列结构分析表明,这4条序列都依次含有信号肽、N-末端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ等结构区域;序列Gli-Ns-2(FJ713595)在特征区Ⅰ出现了2个提前终止密码子,可能为假基因。序列Gli-Ns-2和Gli-Ns-3(GQ139525)的重复单元为P(F/Y)P(P/Q)(P/Q)Q;这4条序列都含有8或9个半胱氨酸残基;系统进化分析表明,序列FJ713595与柔软赖草和纤毛鹅观草的α-醇溶蛋白基因具有相对较近的亲缘关系,序列Gli-Ns-3、Gli-Ns-4(GQ139526)和Gli-Ns-5(GQ139527)可能为α-醇溶蛋白基因家族中的新类型。对获得的1条ω-醇溶蛋白基因Gli-Ns-1(FJ600500)序列结构分析表明,该序列具有ω-醇溶蛋白典型的信号肽、N-末端区和部分重复区序列,但在重复区内出现了1个提前终止密码子,可能为假基因。系统进化分析显示,其可能为ω-醇溶蛋白基因家族中的新类型。华山新麦草的HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白基因的分子克隆和序列分析,以及华山新麦草1Ns异附加系的培育及其品质效应的研究,对丰富小麦品质遗传种质资源、研究和利用华山新麦草优异基因、开发和保护这一珍稀濒危物种具有重要意义。