慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia, CML）是一种起源于骨髓多功能造血干细胞的恶性增殖性疾病，费城（Ph’）染色体t(9;22)(q34; q11)是其特征性的细胞遗传学标志，该易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因abl和22号染色体（22q11）上的bcr基因发生重组，从而形成疾病分子生物学标志bcr/abl融合基因。权威文献报道，慢粒患者（95%以上）体内细胞均表达恒定的、特征性的分子标记bcr/abl融合基因。因此检测该融合基因对疾病的早期诊断、病程进展监测及骨髓移植等治疗后产生微量残留白血病的诊断等都具有非常重要的意义。目的：本研究将以bcr/abl融合基因为检测目标，联合石墨烯、聚苯胺和金纳米粒子等纳米材料的优点，采用发卡结构DNA作为检测探针，通过生物素与亲和素-辣根过氧化物酶结合，采取层层放大技术，研究一种灵敏度高、特异性强的电化学DNA传感器。方法：1.电极表面的材料修饰：依次将壳聚糖分散的石墨烯单体、聚苯胺和金纳米粒子修饰于玻碳电极表面，以制备功能化修饰的反应界面。2.检测探针的固定与杂交：末端修饰有生物素的发卡结构检测探针通过Au-S键固定于电极表面纳米材料复合层，利用碱基互补配对原则，与目标核酸链进行杂交反应。3.酶与底物的反应及电化学信号的检测：与互补目标链的杂交可使检测探针的发卡结构完全打开，暴露出连接在其末端的生物素，通过生物素-亲和素的特异结合，将链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶锚定于电极表面，待与底物反应后产生可供检测的电化学信号，定量反应待测目标链的浓度。4.优化DNA传感器检测的实验条件：检测探针浓度、探针固定时间、链霉亲和素-碱性磷酸酶浓度和杂交反应时间。5.电化学传感器性能的考察：在最优条件下绘制标准曲线，并对传感器的选择性、稳定性和重复性进行分析。6.实际标本的检测：分别检测K562细胞、慢粒患者白血病细胞和非白血病细胞PCR扩增后的融合基因片段。结果：1.对电极表面的层层修饰过程进行电镜和电化学的表征分析。扫描电镜可见壳聚糖分散的石墨烯均匀平铺于玻碳电极表面，苯胺成功地电化学聚合于石墨烯层形成PANI层，金纳米粒子形成树枝状结构沉积于纳米材料上。原子力显微镜发现检测探针大量地固定在所修饰的电极表面。循环伏安法和电化学阻抗分析分别证实了电极表面纳米材料的层层修饰过程。2.所制备的DNA传感器表面发生的氧化还原反应受扩散控制，当检测探针浓度为800nM，固定时间为17h，杂交反应时间为120min和SA-AP浓度为0.5μg mL-1条件下，其电流响应最好。最佳条件下，对目标链进行检测，在10～1000pM范围内信号与目标物浓度呈线性相关，回归方程为I=2.493log C0.810，R2=0.992，计算得到最低检测限为2.11pM （S/N=3）。3.该传感器性能良好：能较灵敏地分辨单碱基、多碱基错配及完全不互补链；4℃干燥情况下保存14天，检测结果发现电流响应与初始相比下降了7.8%；相同条件下制备一批5个DNA传感器，检测100pM，300pM，500pM和800pM目标链，得到相对标准偏差（RSD）分别为4.2%，4.8%，3.6%和5.4%。4.分别从K562细胞、慢粒白血病细胞和非白血病细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA后进行PCR扩增，随后用所制备的DNA传感器检测电流信号。DPV结果显示：bcr/abl融合基因在K562细胞和阳性病人白血病细胞中是高表达的，该传感器可以灵敏地分辨出阳性与阴性标本。结论：本研究结果表明，壳聚糖能够增加石墨烯的水溶性，将其良好地分散在电极表面，提高传感器的导电性能和促电子传递能力。聚苯胺可以进一步增大电极有效表面积，并促进金纳米粒子的大量沉积。金纳米粒子比表面积大、生物亲和性高，不仅能够增强电子传递能力，而且可以大量捕获检测探针，从而极大地扩大电流响应，提高了检测灵敏度。该DNA传感器拥有较宽的检测范围，较低的检测限和较灵敏的特异性。并对实际样本的PCR产物拥有满意的检测结果。