【摘 要】
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目的:探索BBS7基因与SIRT2基因之间的相互作用关系;研究BBS7对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期的影响作用。探究BBS7基因对赖氨酸乙酰化、泛素化影响。通过以上内容来进一步了解BBS的致病机制,为BBS患者的治疗提供更多的思路。方法:用pENTERBBS7重组质粒瞬时转染293T细胞构建BBS7高表达细胞模型;利用Crispr/Cas9技术将BBS7p X458-574、BBS7p X458-
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目的:探索BBS7基因与SIRT2基因之间的相互作用关系;研究BBS7对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期的影响作用。探究BBS7基因对赖氨酸乙酰化、泛素化影响。通过以上内容来进一步了解BBS的致病机制,为BBS患者的治疗提供更多的思路。方法:用pENTERBBS7重组质粒瞬时转染293T细胞构建BBS7高表达细胞模型;利用Crispr/Cas9技术将BBS7p X458-574、BBS7p X458-593重组质粒瞬时共转染293T细胞,构建BBS7敲低细胞模型;用BBS7sh2慢病毒载体进行慢病毒包装并感染293T细胞通过后期抗性筛选构建BBS7稳定沉默细胞模型。并对以上细胞模型分别提取蛋白质、RNA以及DNA,利用Western Blot技术、q RT-PCR技术以及DNA酶切法验证细胞模型是否构建成功。在成功构建以上细胞模型的前提下,利用q RT-PCR技术、Western Blot技术研究BBS7表达水平改变是否影响SIRT2表达,利用免疫共沉淀技术确定BBS7蛋白与SIRT2蛋白是否具有相互结合作用,利用免疫荧光技术针对BBS7与SIRT2进行细胞内共定位。并通过检测细胞周期、细胞凋亡及细胞增殖探索BBS7对细胞功能的影响。再利用Western Blot技术研究BBS7对赖氨酸乙酰化、泛素化水平的影响。结果:本次实验成功构建了BBS7不同表达水平的细胞模型;研究结果显示BBS7基因与SIRT2基因之间存在负相关关系;且BBS7蛋白与SIRT2蛋白具有相互结合作用;BBS7和SIRT2在细胞共定位中相关系数较强;BBS7低表达或者高表达后都对细胞增殖起抑制作用;BBS7低表达促进细胞凋亡发生,BBS7高表达抑制细胞凋亡发生;BBS7不同表达水平导致细胞周期发生变化;挽救实验显示野生型BBS7可恢复细胞功能;BBS7低表达导致赖氨酸泛素化水平升高。结论:BBS7可调控SIRT2基因的表达,但其具体调控机制仍需深入的研究。BBS7对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期以及细胞赖氨酸泛素化具有的影响作用可为进一步阐述BBS的致病机制提供新的思路,为BBS患者的治疗提供新的理论策略。
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