T-bet（T-box expressed in T cells）是一个特异性表达在Th1细胞中并诱导IFN-γ产生的新分子。前期的研究表明它对于Th1细胞的极化和功能发挥着关键性的作用，与另一个转录因子GATA-3成为控制Th1／Th2平衡的关键因素。另一方面，Th1细胞广泛参与了许多免疫性疾病的发生发展过程，其中包括移植排斥反应以及更多、更复杂的自身免疫性疾病如多发性硬化症，类风湿性关节炎，Crohn’s肠炎等。本论文旨在以T-bet为中心，考察该分子在CD 4+T淋巴细胞分化中的表达情况，证实T-bet在一系列细胞免疫相关疾病中的作用，进而考察通过选择性抑制T-bet分子来治疗疾病的可能性、合理性和科学性。 在本研究中，首先证实在正常生理状态下T-bet主要分布在外周淋巴器官，而在体内的其它各大器官和组织中未见明显表达。在免疫应答发生的淋巴结中，存在着较多的T-bet，在脾脏中T-bet也有少量表达。我们进一步在各种类型的细胞株上考察T-bet的表达情况，证实了在活化的Jurkat细胞中T-bet的mRNA水平升高，而在其它细胞系和静止状态的T淋巴细胞株上则基本检测不到该分子。那么，Jurkat细胞在何种活化状态下，在何时间点上表达T-bet呢？体外培养Jurkat细胞，并分别用ConA，PHA和PMA活化的结果表明，来自于有丝分裂原的信号（ConA，PHA）能够诱导出T-bet，而PMA作为PKC通路的激动剂，虽然也能活化T淋巴细胞，却不能引起T-bet的表达。ConA和PHA作用下，T-bet在8小时即已出现，其表达水平持续升高，一直延续到72小时以上。而且T-bet的这种表达时程似乎并未受到增殖抑制的影响。另一方面，anti-CD3结合TCR产生的信号也能促使T-bet开始表达。 其后的实验我们在分离纯化的小鼠脾脏primary T细胞上进行。T细胞的活化和T-bet的表达信号来自anti-CD3结合TCR。结果发现，anti-CD3能够促进T-bet表达，但T-bet的下游分子IFN-γ却未能显示出同样的表达谱。如果在细胞培养的体系中加入IL-12，就能观察到IFN-γ的转录。除此之外，我们又进一步考察了主要的Th1细胞因子信号IFN-γ和IL-12对T-bet水平的影响。实验采了取IFN-γreceptor敲除的小鼠，其野生型小鼠129S1作为对照。细胞用anti-CD3活化，另外分别加入IFN-γ（200U／ml）或IL-12（2.5ng／ml）。结果表明，与野生型相比，IFN-γR-／-抑制了T-bet的表达水平，但对GATA-3的表达水平没有明显影响。另一方面，无论是在IFN-γR-／-／小鼠还是野生型小鼠的细胞中，IL-12的存在与否似乎均未对T-bet的表达水平产生影响。然而，在野生型小鼠细胞中，即IFN-γ信号存在的情况下，IL-12抑制了GATA-3的表达水平。与此同时，我们还使用多种信号通路或激酶的抑制剂，使之作用于anti-CD3活化的T淋巴细胞，以寻找T-bet上游的潜在调控通路。结果表明，P13k的抑制剂wortmanin对T-bet的抑制效应最为明显，Jak-2-PTK抑制剂Typhostin，G2／M阻滞剂Apigenin次之，钙调磷酸酶抑制剂W7又次之，而MAPK的抑制剂PD98059和PKC的抑制剂Bisindolylmaleimide对T-bet表达几乎没有影响。这些现象均需要进一步的思考和研究。 上述结果初步展示了T-bet在细胞中从无到有的过程。然而，Th1细胞作为免疫相关疾病中的重要效应细胞，T-bet分子作为Th1细胞中特异性的转录因子，它在Th1介导的病理过程中又有什么样的表现呢？为了证实这个问题，我们选择了三个T细胞介导的免疫相关疾病的动物模型，观察了T-bet分子在发病过程病中和病灶局部的表达情况。 首先，模拟Crohns疾病，采用TNBS诱导的Th1肠炎模型。从宏观上观察，模型建立以后，动物出现腹泻，体重降低甚至死亡，肠道充血、水肿、粘连；病理组织学检查发现局部有大量炎症细胞的浸润、杯细胞丢失、组织结构破坏等。我们分别检测了肠道淋巴组织colonicpatches和肠组织浸润淋巴细胞表达转录因子T-bet和Th1相关细胞因子的情况。结果表明，与对照相比，在TNBS肠炎模型中，T-bet有着明显的表达升高。与此一致的是，其它Th1细胞因子IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α以及炎症因子MMP-9也有高表达。T-bet在此疾病中的大量表达提示了该分子在发病机理中的的重要作用以及作为治疗靶点的可能性。 其次，我们采用半抗原Picryl chloride诱导小鼠耳肿胀模型，观察T-bet分子在这一疾病中病理局部的表达时程与疾病发生的关系。结果发现，Picryl chloride耳廓涂布后，在12小时开始观察到小鼠的耳廓肿胀，肿胀持续增加，于24小时达到顶峰。不同时间点的组织IRNA样本显示。在局部淋巴结中，T-bet分子开始即有少量表达，在18小时出现大量表达，持续到24小时以后。IFN-γ的出现时间与T-bet相似。而在耳廓部位，T-bet和IFN-γ先后出现在24小时和18小时的时间点上。检测在炎症部位的T-bet的表达时程，可以表征Th1细胞在炎症局部的出现和功能发挥，有助于进一步了解该疾病的病理机制。 最后，我们还在类风湿性关节炎（RA）的动物模型：胶原诱导的大鼠关节炎（CIA）中观察到了T-bet的表达。该模型是典型Thl细胞介导的自身免疫性疾病，大鼠发生疾病以后，可观察到体重增长减缓，出现整个足爪肿胀。取出关节部位的滑膜组织，来自模型动物的样本可以检测到T-bet、IFN-γ和TNF-α的高表达。另取模型动物的脾脏分离脾细胞，体外用II型鸡胶原（1×10<-4>g/mL）刺激。RNA检测的结果表明鸡胶原刺激和未刺激的细胞中T-bet分子及IFN-γ、1NF-α的表达水平有明显差异。被特定抗原活化的细胞表达T-bet、IFN-γ和TNF-α增多。 上述结果表明，T-bet分子广泛参与了Th1细胞介导的免疫性疾病。那么，可否把T-bet分子作为病理过程中的关键性分子和靶点，通过抑制T-bet来治疗疾病呢？我们首先采用了RNA干扰的技术来特异性降低胞内甚至体内的T-bet水平，在此基础上又选取了一个T细胞介导的免疫性疾病：ConA肝损伤模型，借以回答这个问题。 我们首先构建了T-bet强制表达的载体pIRES-EGFP-T-bet，以此为平台设计并构建、筛选出能有效抑制T-bet mRNA和蛋白水平的RNA干扰载体。将T-bet的RNAi质粒静脉注射（100μg/mL/mouse），可以改善ConA诱导的肝损伤，降低转氨酶水平，抑制组织损伤。同时RT-PCR结果表明，RNAi质粒对疾病的抑制作用直接来源于它对T-bet分子表达的干扰作用。 通过RNA干扰的手段“定点”消除T-bet的作用，证实了对T-bet的抑制可直接导致对T细胞介导疾病ConA致肝损伤模型的抑制。不仅如此，我们更加关心小分子化合物能否选择性地抑制T-bet或其相关信号通路，从而达到治疗疾病地目的。实验室多年来的研究支持我们选择出一个新化合物——黄柏内酯，可能具有这方面的潜能。结果表明，黄柏内酯能够治疗T细胞介导的疾病——ConA肝损伤模型，表现为显著降低血清转氨酶和乳酸脱氢酶的浓度；肝损伤炎症局部有Th1特异性转录因子T-bet的大量表达，而黄柏内酯能够抑制这种作用；体外试验表明，与CsA同时抑制Th1和Th2细胞的作用不同，黄柏内酯只是明显抑制Th1细胞表达T-bet和IFN-γ，而对Th2细胞表达GATA-3和IL-4几乎无影响。这些现象都说明了黄柏内酯应该是作用于Th1细胞相对特异的信号通路，可能是针对1-bet分子及其相关通路的作用。 总之，本研究证实了T-bet是特异性地表达在活化地T淋巴细胞中，它的产生可由TCR信号和有丝分裂原信号所诱导，但不受PKC通路激活的影响。T-bet接受的细胞因子信号有IFN-γ，其自身表达不需要IL-12作用，但其启动IFN-γ转录的时候需要IL-12的协同。此外，它的表达还可能受到PI3k通路，Jak-2-PTK通路，钙调磷酸酶通路以及细胞周期的影响。T-bet广泛出现在各种Th1细胞介导的疾病中，如肠炎，类风湿性关节炎，DTH反应等，这样就提示了T-bet作为疾病治疗靶点的可能性。我们用RNA干扰技术证明通过直接抑制T-bet治疗疾病是可行的，同时又大力寻找能够抑制T-bet的小分子潜在药物。本研究表明F-bet分子的分布、表达和参与病理过程是具有特异性的，而通过选择性作用于F-bet分子从而治疗T淋巴细胞相关的免疫性疾病亦是可行的。