植物生长发育过程中,次级代谢发挥着非常重要的作用,而糖基化修饰作为次级代谢过程的一种,有着不可替代的作用。植物体内的糖基化修饰是指植物体内的糖基转移酶通过催化作用把糖基转移到各种各样的植物分子上,从而改变这些分子的特性,影响其功能,最终影响植物的生长发育与环境互作。然而,糖基转移酶这个超家族大多数成员的功能并不是很清楚。本研究中主要对拟南芥糖基转移酶基因UGT79B2/79B3以及玉米糖基转移酶基因UGT787在非生物胁迫响应过程中的作用及其机制进行了分析。本论文的主要研究内容及结果如下:1.拟南芥糖基转移酶基因UGT79B2/79B3的功能研究根据可公开获得的芯片数据预测,糖基转移酶基因UGT79B2/79B3可能参与植物的逆境响应过程。为了研究这两个基因的功能,首先通过qRT-PCR技术调查了这两个基因的表达受逆境诱导的情况。发现UGT79B2/79B3的转录水平明显受盐、甘露醇、ABA、低温等多种逆境胁迫的诱导。克隆了糖基转移酶基因UGT79B2/79B3,并构建了UGT79B2/79B 的过表达载体,通过遗传转化获得了高表达的转基因纯合株系。同时,通过CRISPR/Cas9技术和RNAi干扰技术,获得了 ugt79b2/79b3双突变体和ugt79b2/b3双RNAi干扰株系。对培养皿中的UGT79B2/79B3的过表达株系和突变株系进行了盐、甘露醇、低温、ABA等逆境胁迫处理,调查了它们在萌发率、子叶转绿、根长几个方面了生长变化,发现过表达株系表现出明显增强的逆境耐受能力,而双突变株系则对逆境更加敏感。对土壤培养的过表达系和突变系进行了盐胁迫和干旱胁迫,发现过表达株系有明显的耐盐耐旱能力,而突变系耐逆能力降低。同时进行了冷冻胁迫实验,发现过表达株系耐冷冻能力明显增强,而突变体株系耐逆性降低。脯氨酸和可溶性糖参与植物细胞的渗透作用,一般作为响应逆境胁迫能力的生理学指标。因此,测定了在高盐、干旱等环境胁迫下,过表达株系与双突变体的脯氨酸和可溶性糖的含量,发现过表达株系中脯氨酸、可溶性糖含量比野生型明显提高,而双突变体中的含量明显降低。还通过qRT-PCR检测了逆境胁迫下,各株系逆境胁迫相关基因的表达情况。发现过表达株系中的抗逆基因DREB1B、DREB2B、AREB2、RD29A、COR47等明显上调,而在突变体中这些基因都明显下调。为了探讨UGT79B2/79B3基因是如何对逆境胁迫做出响应的,对UGT79B2/79B3的启动子区域进行了分析,发现UGT79B2/79B3的启动子区域含有DRE等多个逆境相关的响应元件。通过对这些元件的定点突变、EMSA实验、酵母单杂交以及ChIP实验,证明了逆境响应转录因子CBF1/DREB1B能够直接结合UGT79B2/79B3的DRE元件并调控UGT79B2/79B3在逆境下的表达水平。利用cbf1的突变体和过表达体也证明了它对UGT79B2/79B3基因表达的调控作用。那么UGT79B2/79B3在下游又是如何发挥耐逆作用的?寻找它们的作用底物将是解开谜团的关键。UGT79B2/79B3属于拟南芥糖基转移酶第Ⅰ家族的成员,理论上催化小分子物质的糖基化。通过体外酶促反应对植物天然小分子物质进行筛选,发现UGT79B2/79B3能专一性地高效率催化花青素和3-O葡糖糖花青素的鼠李糖基化,对槲皮素、山奈酚只有微弱的活性。对各个转基因株系的总花青素进行测定,发现UG79B2/B3过表达株系中总花青素积累量显著上升,ugt79b2/79b3双突变体株系中总花青素含量显著下降。在连续光照条件下,发现UGT79B2/79B3过表达株系的下胚轴和叶片紫红色比野生型更深,而ugt79b2/79b3的双突变体颜色比野生型更浅。另外,在逆境处理下,发现花青素合成途径的关键基因在过表达株系中显著上调,而在双突变体中明显下调。以上结果表明,UGT79B2/79B3可能通过花青素途径发挥耐逆作用。利用花青素合成途径的突变体tt18对以上假设进行了进一步验证。当在花青素合成途径的突变体tt18的背景下超表达UGT79B2/79B3时,发现超表达体的耐逆性消失。相反,当在黄酮合成途径的突变体tt7背景下超表达UGT79B2/79B3时,却发现超表达体的耐逆性仍然存在。这一结果强有力地说明了UGT79B2/79B3是通过花青素途径而不是通过黄酮途径发挥耐逆作用的。植物体在逆境环境中,会产生大量的活性氧物质,影响植物体的生长发育。已有报道花青素能够清除活性氧,增强抗逆性。测定了过表达体和突变体总的抗氧化能力,发现过表达体总的抗氧化能力增强,突变体则相反。通过DAB和NBT染色实验也同样发现过表达株系清除活性氧能力加强,而突变株系和RNAi干扰株系清除活性氧能力减弱。因此,我们认为在逆境胁迫下,转录因子CBF1等直接调控了 UGT79B2/79B3上调表达,通过花青素糖基化促进了花青素途径加快运转并造成花青素积累,进而通过增强的活性氧清除能力,使植物表现出增强的耐逆性。2.玉米糖基转移酶基因ugt787参与植物耐逆性的研究玉米GT1糖基转移酶家族同样是一个大的基因家族,包含147个成员。然而功能得到鉴定的却少之又少。为此经过芯片数据分析,选择了一批玉米糖基转移酶的候选基因,对它们进行克隆以及原核蛋白的表达纯化,经过体外酶活性鉴定,我们发现UGT787对黄酮类物质槲皮素、山奈酚、柚皮素等有催化活性,其中对前两者的催化活性非常高。由于黄酮类物质和植物对逆境的响应密切相关,我们对UGT787在逆境下的表达情况进行了分析,发现其受到盐和干旱的明显诱导,同时还发现UGT787受到槲皮素、山奈酚等底物小分子物质的明显诱导,我们还分析了 UGT787在玉米不同生长时期和不同部位的表达情况,发现UGT787的表达非常广泛。因此,我们预测UGT787在植物体内具有重要的功能。我们从Uniform Mu突变体库购买得到了 UGT787的两个转座子插入突变体689和943,对它们进行了盐和干旱的胁迫处理,并观察其生长情况,发现两个突变体在种子萌发、根长、幼苗抗逆方面都表现出敏感的表型。对野生型、689和943三种植株的幼苗提取总黄酮,发现不管在正常生长条件下还是在逆境胁迫条件下,与野生型相比,689和943都积累了较少的黄酮,说明这可能是689和943对逆境敏感的原因。为了更好地验证UGT787的功能,我们将其在拟南芥中进行了超表达,发现35S::UGT787转基因拟南芥在种子萌发、子叶转绿率、根长以及土壤中盐旱等情况下,转基因拟南芥都表现出逆境胁迫增强。结合UGT787体外酶促反应能够糖基化黄酮类物质,我们对转基因拟南芥中的总黄酮含量进行分析,我们发现在正常生长条件下和盐、干旱等胁迫处理条件下,转基因拟南芥中都比野生型积累了更多的黄酮。植物体内积累黄酮含量的高低与植物体对抗逆境胁迫的能力具有一致性。为了进一步探讨玉米糖基转移酶UGT787参与逆境胁迫的机制,在高盐、干旱等环境胁迫下,我们测定玉米突变体689,943与野生型的一些耐逆生理指标,发现玉米突变体中脯氨酸、可溶性糖、POD、SOD、CAT、H2O2含量和野生型相比明显降低。同时我们也测定了拟南芥过表达株系与野生型的一些耐逆生理指标,发现拟南芥中过表达株系的耐逆生理指标都比野生型明显增加。DAB染色,逆境胁迫下,玉米突变株系中的颜色要比野生型浅,转基因拟南芥中的颜色要比野生型深。表明玉米中突变体株系清除活性氧能力弱,而拟南芥中过表达株系清除活性氧能力强。检测玉米突变株系和转基因拟南芥中的黄酮合成途径相关基因,逆境胁迫处理后,发现玉米突变株系中黄酮合成途径相关基因下调表达,转基因拟南芥中黄酮合成途径相关基因明显上调表达。紧接着继续检测抗逆相关基因的表达变化,发现玉米突变株系中抗逆基因下调表达,发现拟南芥中过表达株系中的抗逆基因KIN1、RD291、RD29B、COR47、POD、GAT等明显上调。根据前人的报道,我们知道植物体内的次级代谢物黄酮类物质与植物体的抗氧化相关,玉米突变体ugt787中黄酮含量降低,经过测定其清除活性氧的能力也降低了,并且对逆境胁迫敏感,而拟南芥过表达体UGT787中黄酮含量增加,其清除活性氧能力也增强了,同时对逆境胁迫表现出耐受力增强。因此我们推断,在玉米中UGT787的过表达体通过糖基化黄酮代谢途径的槲皮素和山奈酚,推动黄酮代谢途径的进行,进而积累更多植物体内次级代谢物黄酮,加强了对植物体内有毒物质活性氧的清除,进而增强了植物体对逆境胁迫的抵抗力。