研究背景和目的:红细胞分化是一个需要精细严谨调控的复杂过程,正常的红系分化过程可以分为三个阶段:早期分化,终末分化和网织红细胞成熟。既往关于红系分化调控机制的研究主要集中阐释了细胞因子和转录因子的作用和机制,如促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受体(EPO Receptor,EPOR)通路和GATA1、KLF1等红系分化关键转录因子。近年来研究发现在哺乳类动物基因组中DNA甲基化/去甲基化作为重要的表观遗传修饰方式之一在造血干细胞自我更新等过程中起到重要的调控作用,但在红系分化过程中的作用尚不清楚。TET家族是介导DNA去甲基化的关键酶,本课题组前期RNA-seq结果发现TET3是红系终末分化阶段表达最高的TET家族成员,且随着分化进行表达逐渐上升,提示TET3在红系终末分化中可能起到重要作用。因此,本课题拟分选红系终末分化阶段各期有核红细胞,通过DNA甲基化测序建立DNA甲基化动态谱,联合运用多组学研究手段和功能基因组学研究方法进一步探讨TET3在人红系分化各特定阶段的调控作用和分子机制,以期明确TET3介导的DNA去甲基化在人红系终末分化过程中的阶段性调控作用及分子机制。此外,本研究构建了在红系细胞中特异性敲除Tet3的小鼠模型(Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠),利用该小鼠模型,进一步在体内水平验证了Tet3在红系发育进程中的调控作用。本研究的结果为深入理解红系分化调控机制提供新的思路和理论基础。研究方法:(1)利用课题组已建立的分选纯化人类红系终末分化过程中各特定阶段有核红细胞的方法得到纯化的各特定阶段有核红细胞,进行增强型简化代表性亚硫酸盐测序法(Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing,ERRBS)检测,分析人类红系终末分化过程中基因甲基化动态变化,建立动态甲基化谱。(2)为研究TET3在人红系分化中的作用,我们分离得到脐带血CD34+造血干细胞后,利用慢病毒转染敲低TET3表达,诱导向红系定向分化,通过quantitative real-time PCR检测敲低效率,以流式细胞技术检测红系分化进程、细胞凋亡及脱核效率,通过细胞计数绘制生长曲线,并以细胞甩片观察细胞及细胞核形态。(3)分选纯化对照组和TET3敲低组红系终末分化过程中各个阶段有核红细胞提取RNA,建立c DNA库,进行RNA-seq检测,利用生物信息学软件Tophat2、HTSeq和DESeq2对测序结果进行质量检测、序列比对、基因表达水平分析和基因表达差异分析等,建立TET3敲低后各特定阶段有核红细胞的转录谱。(4)分析对照组和TET3敲低组转录谱,查阅文献比对差异表达基因功能,发现TET3敲低后晚期有核红细胞表达下降基因前十位中的KLHDC8B基因与细胞的有丝分裂关系密切,提示其可能参与了晚期有核红细胞细胞核形态以及脱核的改变。进一步我们通过功能缺失和获得实验,构建KLHDC8B sh RNA载体和过表达载体,用Quantitative real-time PCR和Western Blot检测敲低效率和过表达水平,在红系分化的晚期,利用流式检测脱核率,细胞甩片观察并定量分析KLHDC8B敲低后以及TET3敲低联合KLHDC8B过表达时双核或多核细胞比例的变化。(5)运用质谱方法检测TET3敲低后晚期有核红细胞5-m C和5-hm C的改变;运用甲基化特异酶切分析法以及Me DIP-real time PCR检测TET3敲低后KLHDC8B启动子甲基化状态的变化。此外,我们还运用ATAC-seq检测TET3敲低后红系分化晚期细胞染色质易接近性的改变,以期明确TET3敲低后是否通过影响染色质的易接近性从而影响特定基因的表达。(6)根据课题组前期建立的分选纯化小鼠体内红系终末分化过程中各个阶段有核红细胞的方法得到纯化的各个阶段的有核红细胞,进行HELP(Hpall tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR)检测。利用生物信息学方法分析已建立的转录组数据库,观察Tet家族成员在小鼠红系终末分化进程中的表达趋势,构建在红系干祖细胞阶段Tet3被特异性敲除的小鼠模型,检测野生型和Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠在正常情况下和应激情况下外周血常规变化趋势,同时检测其骨髓各期红细胞变化以及脾脏变化。结果:(1)红系发育过程是一个受到精密调控且呈多阶段变化的过程,因此,我们分选出人红系分化过程中各特定阶段有核红细胞,进行ERRBS检测,结果发现全基因组出现累积性的去甲基化改变,而且是一个动态变化的过程,不同分化阶段细胞向下一阶段细胞分化时基因甲基化改变不完全相同。(2)通过对课题组前期获得的RNA-seq数据分析发现,在人类红系终末分化过程中,TET家族中TET3的表达水平最高且随着分化进行逐渐升高。因此,我们推测TET3在人类红系发育中可能起到重要的调控作用。(3)利用本实验室已建立的原代CD34+造血干细胞定向红系分化方法,以慢病毒感染进行TET3敲低,发现TET3敲低后引起红系从早期分化向终末分化过程延迟,但是并未被阻滞;分化过程中细胞增殖减少并伴有细胞凋亡增加;细胞脱核减少且晚期细胞中双核或多核细胞增多。(4)由于TET3在晚期有核红细胞中表达最高,并且我们发现TET3敲低后晚期有核红细胞中出现双核或多核现象且脱核受到明显影响。因此,为了进一步探讨TET3敲低后双核以及多核增多等的相关机制,我们分别分选出对照组和TET3敲低组红系终末分化各特定阶段有核红细胞,进行了RNA-seq检测,运用Tophat2、HTSeq和DESeq2等生物信息学软件对测序结果进行分析,主要成分分析(principle component analysis,PCA)结果显示对照组和TET3敲低组各自的相同阶段有核红细胞转录组测序结果一致性高。相同阶段的有核红细胞中,对照组和TET3敲低组存在明显的差异,尤其是Poly期和Ortho期,差异最明显,这与TET3敲低后表型主要出现在晚期以及TET3在晚期表达最高的数据均是一致的。对表达差异基因分析发现TET3敲低后主要影响了红系终末分化中晚期有核红细胞内基因的表达,而且与有丝分裂相关的KLHDC8B基因表达下调位居前列,结合KLHDC8B与霍奇金淋巴瘤患者“镜影细胞”形成相关,我们推测KLHDC8B的下调可能与晚期有核红细胞的双核或多核现象相关。(5)慢病毒转染敲低KLHDC8B的表达后对红系分化以及增殖无明显影响,但引起红细胞脱核率明显降低且晚期有核红细胞中双核或多核细胞明显增多,这与TET3敲低后出现的晚期有核红细胞表型一致;之后我们在TET3敲低的情况下进行了KLHDC8B的过表达补救实验,补救实验发现KLHDC8B表达恢复后可以使双核或多核现象明显减少。(6)为了探讨TET3如何影响KLHDC8B的表达,首先我们利用质谱对红系发育各特定阶段细胞进行了5-m C和5-hm C的检测,结果发现TET3敲低后原始红细胞(Proerythroblasts,Pro)、早期早幼红细胞(Early Basophilic erythroblasts,Early Baso)、晚期早幼红细胞(Late Basophilic erythroblasts,LateBaso)和中幼红细胞(Polychromatic erythroblasts,Poly)阶段5-m C水平没有明显改变,然而在晚幼红细胞(Orthochromatic erythroblasts,Ortho)阶段基因TET3敲低组与对照组相比5-m C水平变化虽然没有显著统计学差异(P=0.053),但是其水平确有明显升高。5-hm C水平因基数太低检测不出明确结果;之后我们对KLHDC8B的特异位点甲基化状态进行了检测,结果显示KLHDC8B启动子内Cp G到以及启动子片段均未发生甲基化修饰;由于TET3可以影响染色质的开闭,为了研究TET3敲低后是否影响了晚期红细胞染色质的开闭,我们进行了ATAC-seq的检测,ATAC-seq结果显示在30259个合并区域仅仅发现了329个差异表达峰,这使得我们在分子功能,生物学过程和细胞组成聚类分析时没有足够的富集。分析KLHDC8B的位点亦没有发现明显的染色质易接近性差异。这结果提示TET3敲低后不影响KLHDC8B基因位点的染色质易接近性。但是鉴于我们仅对晚幼红细胞进行了ATAC-seq分析,不排除TET3对早期有核红细胞如早幼红细胞和中幼红细胞的染色质易接近性有影响。另外上述结果也提示TET3通过间接作用对KLHDC8B的表达进行调控,但是由于我们尝试了目前市售所有TET3抗体,均不能有效识别人类红系分化过程中细胞内的TET3蛋白,因此无法进行免疫共沉淀等以检测TET3是否通过调控其他蛋白的表达从而引起KLHDC8B表达的下调,后续我们会对此进行进一步的研究。(7)分选小鼠红系终末分化各特定阶段有核红细胞进行HELP检测,结果发现小鼠体内红系终末分化中基因启动子区也出现去甲基化趋势,而且调节去甲基化的Tet家族中Tet3的表达最高且随着分化进行逐渐升高,这与人类红系发育各特定阶段有核红细胞TET3表达结果一致;因此,进一步研究Tet3在小鼠红系发育中的调控作用对研究红系发育的表观遗传调控将会起到重要的作用。(8)由于Tet3敲除具有胚胎致死性,因此,我们利用Cre/Loxp重组酶系统建立了红系条件性Tet3敲除鼠即Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠,该小鼠模型可以实现仅在红系细胞内敲除Tet3。经PCR以及电泳检测Epor-GFPCre Tet3条件性敲除小鼠建立成功后,定期检测Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠与野生型小鼠在正常情况下外周血常规进行比较发现没有明显区别。有文献报道Tet3在应激条件下起到重要的调控作用,因此,我们对小鼠进行了腹腔注射苯肼(Phenylhydrazine,PHZ),使小鼠出现急性贫血,进入应激状态。经观察发现,与野生型小鼠进行对比,Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠外周血红细胞计数,血红蛋白,红细胞压积,网织红细胞计数恢复减慢,骨髓中Orthro期细胞比例明显增多,网织红细胞和成熟红细胞比例明显减少,Pro,Baso和Poly期细胞无明显变化,并且脾脏明显增大,这些结果提示Tet3可能在应激情况下对红系晚期细胞发育起到重要的调控作用。结论:(1)人类和小鼠红系终末分化中全基因组呈现累积性去甲基化变化;(2)TET家族在人类和小鼠红系终末分化中均是TET3表达最高,且随着分化的进行逐渐升高;(3)TET3敲低后人类红系终末分化过程中细胞增殖减慢,凋亡增加,出现双核或多核现象并且脱核率减少;(4)TET3敲低后通过下调KLHDC8B的表达使得晚期有核红细胞中出现明显增多的双核或多核细胞;(5)TET3敲低后引起Orthro期细胞5-m C明显升高;KLHDC8B启动子区没有甲基化修饰,TET3对其染色质易接近性的作用有待进一步研究;(6)在小鼠红系进行Tet3条件性敲除后影响应激情况下红系发育。