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动脉粥样硬化(As)是一种发生在大、中动脉的慢性炎症性疾病。载脂蛋白A-I(apoA-I)的天然半胱氨酸突变体apoA-IMilano(A-IM)和apoA-IParis均表现出增强的心血管保护活性,二聚体是其主要的活性形式。根据apoA-I的结构特点和上述突变体发生突变的特殊位置,本课题组自行设计并构建了7个apoA-I的半胱氨酸突变体。我们前期实验所诱变的半胱氨酸突变体在体外也可以不同程度的形成二聚体,本实验选用其中极易形成二聚体的A-I(S228C)突变体进行初步研究。[目的]原核表达并纯化重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和野生型AI(WT-AI)。以内毒素血症大鼠为炎症模型,通过与WT-AI和AIM比较,重点观察A-I(S228C)突变体的抗炎和抗氧化作用,探讨对炎症和多器官功能损害的保护作用及机制,以期为其抗As提供实验依据,并为我们深入理解apoA1结构与功能的关系奠定基础。[方法]利用pET原核表达系统表达重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI,Ni2+亲和柱进行目的蛋白纯化,经TritonX-114和Pierce亲和柱去除内毒素,鲎试剂法检测内毒素合格后与大豆卵磷脂包装形成脂质体。采用阴茎背静脉注射内毒素复制内毒素血症大鼠模型;30只雄性Wister大鼠随机分为六组:盐水对照组(生理盐水+生理盐水,n=4)、模型组(生理盐水+内毒素,n=4)、磷脂对照组(大豆卵磷脂+内毒素,n=4)、WT-AI组(WT-AI+内毒素,n=6)、A-IM组(A-IM+内毒素,n=6)和A-I(S228C)突变体组(A-I(S228C)+内毒素,n=6)。各组动物实验前及内毒素注射后6小时,剪尾取血,分离血清,采用酶法测定血清脂质含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β, IL-6和粘附分子ICAM-1的含量,试剂盒检测血清ALT、AST、Urea、Cre和CK等反映肝肾肌组织功能指标的含量,MDA、NO和T-AOC试剂盒测定血清脂质过氧化程度及总抗氧化能力。将大鼠固定,PBS灌流,取心、肝、脾、肺、肾组织置于10%中性福尔马林中固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色,光镜观察组织病理结构改变、白细胞浸润等。[结果]重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI表达量超过10mg/L菌液,经Ni2+亲和柱纯化及TritonX-114和Pierce亲和柱去除内毒素后,纯度达到90%,内毒素含量达到注射标准。内毒素血症模型大鼠出现炎症表型。A-I(S228C)突变体组与模型组相比,大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和粘附分子ICAM-1含量(P<0.01)以及血清ALT、AST、Urea、Cre和CK水平显著降低(均为P<0.05);血清MDA和NO含量显著降低(分别为:P<0.01和P<0.05);机体总抗氧化能力显著增加(P<0.01);光镜观察肺组织病理结构改变和白细胞浸润得到明显改善。[结论]1、获得大量高纯度的WT-AI及A-IM、A-I(S228C)突变体蛋白。2、成功复制内毒素血症大鼠模型。3、重组蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清炎症因子及粘附分子水平。4、重组蛋白A-I(S228C)能增强大鼠机体的总抗氧化能力,并抑制血清脂质过氧化。5、重组蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清肝、肾、肌功能指标含量,改善肺组织病理结构改变及白细胞浸润,提示对大鼠肝脏、肾脏、肺脏、骨骼肌和心肌等多种组织器官具有保护作用,其保护作用机制可能与其抗炎和抗氧化作用有关。6、重组蛋白A-I(S228C)的抗炎、抗氧化及对多器官功能损害的保护作用与A-IM比较未见明显差异,是否同样具有抗As作用有待于进一步探讨。