消费者主要从柑橘类果实中获取天然的聚甲氧基黄酮（Polymethoxylated flavones,PMFs）。作为具有特殊生物活性的功能性成分,PMFs对人体健康有益,且对柑橘生长逆境有防御作用。宽皮柑橘果实黄皮层中大量积累PMFs,但作为类黄酮代谢的支路,PMFs代谢和调控机制尚未明晰。因此,本研究首先通过反向遗传学手段:整合代谢组和转录组分析筛选PMFs生物合成相关O-甲基转移酶基因（OMTs）、利用体外异源表达和柑橘体内转基因等功能验证手段,再结合正向遗传学手段:通过人工杂交群体BSA-seq定位关键基因等方法鉴定了柑橘PMFs生物合成相关的3个主效基因并初步构建了红橘PMFs生物合成的代谢通路,最后通过分析主效基因在不同柑橘种质中的序列多态性和酶功能,初步阐明不同柑橘种质差异积累PMFs的分子机理。主要研究结果如下:1.柑橘自然种质和几个柑橘人工杂交群体中PMFs谱的分析本研究运用UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS与HPLC分析相结合,对116种柑橘不同组织中的11种主要PMFs进行了综合评价,揭示了PMFs积累的时空特异性和种质特异性。在所调查的自然群体中,PMFs在所有宽皮柑橘种内和种间杂交种质中均能被检测到,尤在果实发育早期的野生或早期栽培宽皮柑橘果实黄皮层中富集,但在柚、枸橼、金柑、枳、宜昌橙、蚝壳刺和莽山野柑等种质中未检测到,表明PMFs的生物合成可能起源于原始宽皮柑橘,PMFs积累表型在自然群体中可能属于显性性状,且与宽皮柑橘相比,其种内和种间杂交种质中PMFs总含量降低。基于多柑橘种质的PMFs代谢谱评价,可对富含总PMFs或特定PMFs的功能性柑橘育种提供理论依据。对6个柑橘杂交子代群体果实黄皮层或叶片中的PMFs进行了分析,发现在红橘（大量积累PMFs）×枳（不积累PMFs）和沙田柚（不积累PMFs）×砂糖橘（大量积累PMFs）F1代杂交群体中积累PMFs的表型发生分离。亲本中积累的PMFs物质种类在部分F1子代中总是同时出现但含量降低,或者不积累,具有PMFs积累表型的子代比例接近1/8或1/9,据此推测F1代中积累PMFs的表型可能属于一种质量性状,且为隐性性状。此外,处红柚和翡翠柚的正交和反交群体中均未检测到PMFs,再次验证柚中PMFs生物合成通路的缺失。2.PMFs生物合成相关基因的筛选和功能验证基于枳、华农红柚和红橘不同组织中差异积累PMFs的代谢特征,本研究结合代谢组和转录组数据筛选红橘黄皮层中高表达的OMTs,同时利用基因共表达分析、相关性分析等方法筛选到18个与PMFs合成相关的候选OMTs。通过酿酒酵母和大肠杆菌异源表达系统表达候选OMTs,经3种底物饲喂,初步确定了5个重组OMT酶对黄酮具有O-甲基化催化活性;进一步添加更多类型的黄酮底物,经LC-MS鉴定产物,初步构建了由芹菜素从头合成红橘中7种PMFs的代谢通路。并经柑橘愈伤组织稳定超表达、烟草和柑橘叶片瞬时注射等实验验证了OMT3、OMT5和OMT7基因在植物体内的生物学功能。其中OMT3和OMT7表现出7-,4′-位保守的O-甲基化催化活性,OMT4和OMT5鉴定为6个位点的多功能O-甲基转移酶,这是首次在植物中验证类黄酮5-O-甲基化功能,初步构建红橘特异的PMFs代谢通路,为提高柑橘果实品质、功能性柑橘育种及工厂化生产PMFs提供理论支撑。3.利用BSA分析定位PMFs生物合成主效基因本研究利用红橘×枳杂交群体F1代中具备PMFs积累和不积累表型的单株进行BSA-DNA测序,进一步利用SNPs分子标记定位到克里曼丁基因组Scaffold4上一段长度为7.58Mb的候选区间,巧合的是该区间包含7个串联排列的OMTs,且OMT3、OMT4、OMT5和OMT6基因序列高度相似,其余3个OMTs在红橘转录组中几乎无表达。其中OMT4和OMT5在3个宽皮柑橘种质的黄皮层中具有极高表达量,且其重组酶对黄酮6个位点具有O-甲基化催化功能,重组OMT3酶仅具有7-和4′-位O-甲基化催化功能,而重组OMT6酶对黄酮无O-甲基化功能,表明OMT3、OMT4和OMT5可能是柑橘中PMFs生物合成的主效基因。4.不同柑橘差异积累PMFs的分子机理和相关转录因子的筛选扩增22种代表性柑橘种质中3个主效OMTs的序列,并利用系统进化树分析110份柑橘重测序数据中3个主效OMTs的序列,均发现不同柑橘种质中3个主效OMTs的序列多态性,大部分不积累PMFs的种质中3个主效OMTs的同源基因出现提前终止,而在积累PMFs的种质中均发现与3个主效基因序列与红橘一致或高度相似。然而,四季橘、红河大翼橙和佛手中3个主效基因序列正常但不积累PMFs,推测可能因为缺少黄酮底物。因此,OMT3、OMT4和OMT5序列多态性导致的酶功能差异是不同种质中PMFs积累差异的重要原因之一,且3个基因序列的系统进化树分析分析可将不同柑橘种类清晰分类。此外还筛选到18个与PMFs生物合成呈正相关的转录因子和1个负相关的转录因子。