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研究背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)作为心脑血管疾病的共同血管病理基础,严重危害人类健康。目前公认的AS危险因素有高脂血症,高血压,吸烟,糖尿病和高胰岛血症等。其中,高脂血症是AS主要危险因素。实验证明,高脂饮食可诱发动物实验性AS斑块的形成。已有报道的关于AS的发病机制过去主要存在脂质浸润、血栓形成和损伤反应三种学说。Ross等在1999年首先提出AS的炎症学说,其认为AS是由于氧化修饰的LDL刺激单核/巨噬细胞启动细胞内一系列的炎症反应。其中单核/巨噬细胞的粘附被认为是AS的早期病变。在ox-LDL、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、TNF等因子的作用下,单核细胞通过粘附分子粘附于内皮细胞表面,迁入内皮下间隙,转化为巨噬细胞,经其表面清道夫受体、CD36等的介导,摄入已发生修饰的脂蛋白,转变为巨噬细胞源性泡沫细胞,泡沫细胞是AS早期脂纹、脂斑的主要成分。葡萄籽原花青素(Oligomeric Proantho Cyanidins,OPC),是一种有特殊分子结构的生物类黄酮,是到目前为止所发现的最强效的自由基清除剂之一。文献报道OPC具有抗心肌缺血再灌注损伤,抗动脉粥样硬化,降低血压,调节血脂等功能,对心血管系统有多方面的保护作用。但对其抗AS的作用机制尚缺乏深入的研究。为此,本研究主要通过观察OPC对泡沫细胞的形成、粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达和泡沫细胞的存活三方面的影响并探讨可能涉及的分子机制。方法与结果1原花青素对ox-LDL诱导的巨噬源性泡沫细胞形成的影响1.1采用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,ox-LDL诱导形成泡沫细胞为模型。用油红“O”染色检测OPC对巨噬细胞内脂质堆积情况的影响和荧光显微镜观察药物对Dil-ox-LDL的内吞,结果:光镜下观察发现,对照组细胞形态多呈圆形,油红“O”染色无着色;模型组油红“O”染色阳性细胞遍布,且细胞体积明显增大,形态多呈圆形,泡沫细胞形成;OPC给药组细胞内红染的圆形颗粒比模型组明显减少,且细胞形态渐趋正常,表明OPC减少细胞内脂质蓄积。荧光显微镜观察发现,模型组细胞内红色荧光遍布,OPC能明显降低RAW264.7细胞内Dil标记的ox-LDL,减少对ox-LDL的摄取。1.2. Realtime-PCR法检测细胞表面清道夫受体CD36、MSR1mRNA的表达。结果表明:ox-LDL组与对照组相比,明显上调了RAW264.7清道夫受体CD36、MSR1mRNA表达(p<0.01)。OPC50μg/ml时显著性抑制ox-LDL刺激引起的巨噬细胞表面CD36、MSR1mRNA的表达(p<0.01)。2原花青素对单核源巨噬细胞ICAM-1、VCAM-1表达的影响2.1C57BL/6小鼠以高脂饲料喂养12周建成高脂血症模型。分别灌胃给予OPC低剂量(20mg/kg/d)、OPC高剂量(50mg/kg/d)、阳性药辛伐他汀(simvastatin)(50mg/kg/d)5周后,流式细胞仪检测小鼠主动脉单核/巨噬细胞表面ICAM-1、VCAM-1的表达变化。结果显示:高脂血症小鼠主动脉中单核/巨噬细胞ICAM-1、VCAM-1的表达增加,OPC明显抑制了高脂小鼠主动脉中单核/巨噬细胞ICAM-1、VCAM-1表达(P<0.05)。2.2以ox-LDL刺激的单核巨噬细胞RAW264.7为模型,采用流式细胞术检测OPC对ox-LDL作用的RAW264.7细胞表面ICAM-1、VCAM-1的表达的影响;并用罗氏xCELLigence系统实时监测OPC对ox-LDL作用的RAW264.7细胞粘附能力的影响。流式结果表明:细胞受ox-LDL刺激后,细胞表面ICAM-1、VCAM-1表达明显增加;与ox-LDL组相比,OPC浓度为50、10、2μg/ml时均可抑制ox-LDL诱导引起的细胞表面VCAM-1的表达(P<0.05);在50、10μg/ml时可明显抑制ox-LDL诱导引起的细胞表面ICAM-1的表达(P<0.05)。罗氏xCELLigence系统实时监测结果显示:细胞受ox-LDL刺激后,细胞的粘附性增强;OPC给药组降低了细胞的粘附性。2.3利用荧光探针DCFH-DA进行细胞内ROS水平的检测,采用流式细胞术检测细胞内ROS的荧光强度。结果显示:ox-LDL作用于RAW264.7细胞24h后能明显增强细胞内ROS的水平(P<0.01);与ox-LDL相比,OPC(50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml)能明显降低细胞内的ROS水平(P<0.01)。3原花青素对ox-LDL诱导的RAW264.7细胞存活率的抑制作用3.1MTT法检测OPC对ox-LDL诱导的巨噬细胞的存活率作用。结果显示:OPC50μg/ml作用于ox-LDL诱导的RAW264.7细胞24h或48h后,能明显抑制细胞的生长。3.2初步探讨自噬在OPC抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞存活率中的作用,运用Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、ERK、 p-p ERK、p38、p-p38的表达。结果显示:ox-LDL处理后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达明显增加,给予OPC(50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml)处理后,可增加LC3Ⅱ的表达;ox-LDL处理后,RAW264.7细胞ERK、p38的磷酸化变化不明显,而给予OPC能明显增加了ERK的磷酸化,对p38的磷酸化作用不明显。结论1. OPC可能通过抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞表面清道夫受体CD36、MSR1mRNA的表达,从而抑制RAW264.7细胞内脂质的蓄积和减少泡沫细胞的形成。2.OPC抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞粘附分子VCAM-1和ICAM-l的表达,减少细胞与ECM的粘附能力;并抑制ROS的产生。3.OPC抑制RAW264.7细胞的存活,其抑制作用可能与诱导细胞自噬有关。总之,OPC通过减少泡沫细胞的形成、巨噬细胞黏附分子的表达、ROS的生成及细胞的存活而发挥抗AS的作用。