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牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支杆菌(Mycobacteriumboris)引起的一种人畜共患的慢性传染病。参考GenBank中ESAT-6基因序列，设计合成了一对含酶切位点的引物，从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA，PCR扩增出ESAT-6基因，克隆进pMD18-T Simple Vector，将测序正确的目的基因亚克隆入表达载体pET-32a(+)中，转化BL21(DE3)宿主菌，构建出重组表达质粒pET-ESAT-6，PCR和BmHⅠ、HindⅢ酶切鉴定表明构建正确。IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量30kDa左右处出现新的蛋白条带，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导起始时间为3h，诱导表达4h后表达量即达到高峰。Western-Blot分析表明，融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别，具有良好的反应原性。表达蛋白可用作基因工程诊断抗原。
收集诱导表达的菌液，超声破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE，结果证明表达产物主要以包涵体形式存在。亲和层析方法纯化表达蛋白，取少量纯化产物进行SDS-PAGE,结果在30kDa处出现清晰单一的特异性蛋白条带，表明表达产物的纯化良好。
用纯化的牛分支杆菌重组ESAT-6蛋白作为包被抗原，建立了检测牛分支杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件为：抗原包被浓度为1.1μg/mL，二抗稀释倍数为1500倍，血清稀释倍数为40倍，抗原和血清、血清和二抗都是在37℃条件下反应30min，底物在37℃显色30min，阴阳性临界值定为：D<,450nm>=0.614。通过阻断试验、交叉试验、重复性试验表明该方法特异性强、重复性好。这为进一步组装成诊断试剂盒奠定了物质基础，为牛结核病的诊断与检测提供了一种良好的技术手段，由于ESAT-6只存在于致病性分枝杆菌中，所以用做特异性诊断抗原，能区别是否为疫苗接种还是其他非致病性分支杆菌感染引起的抗体升高。用建立的间接ELISA方法对20份结核菌素试验阳性牛的血清和38份结核菌素试验阴性牛的血清进行了检测，结果表明阳性血清的符合率为60％，阴性血清的符合率为65.8％。