研究背景和目的随着人们生活水平的不断提高,生活模式现代化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)的发病率逐年增加。据统计,中国的糖尿病发病率高达9.7%,患者近一亿,已成为糖尿病第一大国,糖尿病患者的年龄也日趋年轻化,30～45岁年龄层成为发病增长最快阶段。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病中最常见的微血管并发症之一,发病率约为33%,并已成为终末肾功能衰竭的主要原因,也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。DN的发病机制较复杂,目前尚不明确,但普遍认为持续高血糖等引起的肾脏血流动力学改变、糖代谢异常伴蛋白质及脂肪代谢异常是DN病变的基础,而众多生长因素、细胞因子被激活并引起相应生物学效应是DN病变的直接机制。DN在病理上最早表现为肾脏增大,随着病程延长肾小球毛细血管基底膜逐渐增厚、系膜细胞增生、系膜基质增多,进一步发展出现纤维蛋白原呈线样或颗粒样沿基膜沉着,最后可出现典型的肾小球硬化性病变。目前,凝血功能异常、血栓形成倾向等在糖尿病肾病形成和发展中的作用日益受到重视,有研究显示组织因子(Tissue factor, TF)的高表达及其引起凝血功能紊乱与部分肾脏疾病肾小球硬化、肾单位减少的发生有关。TF,即凝血因子Ⅲ,是外源性凝血系统的启动因子,也是体内活性最强的促凝物质之一,不仅作用于凝血,还与临床的多种疾病密切相关。大量的研究表明DM患者血管内皮细胞TF高表达,外周血浆TF水平显著升高,并与DM多种并发症的发生有关。作为外周血中唯一能表达TF的单核细胞,其TF活性在DM患者中如何改变,是否参与DN的发生尚不得而知。同时如果TF在肾脏内高表达并参与DN病理进程,则可能通过尿液反映出来。因此通过检测尿液TF含量和活性,可了解TF在DN的发生发展中的作用,也可能对DN的早期诊断具有一定的参考价值。本研究旨在建立了一种简便、有效的尿液组织因子促凝血活性(TF procoagulant activity, TF-PCA)检测方法,并探讨2型糖尿病患者尿液TF-PCA、TF抗原含量与糖尿病患者肾功能损伤指标的相关性,了解尿液TF-PCA在DN患者中检测中的价值,为尿TF在DN发病机制中的作用研究提供参考资料。方法1.2型糖尿病肾病患者组织因子检测按照1999年WHO对DM的诊断标准,收集86例2型糖尿病患者的血液、尿液标本。根据尿白蛋白/肌酐比值分成3组：①30 mg/g以下的正常蛋白尿组42例；②30 mg/g<比值<300mg/g的微量白蛋白尿组26例；③300 mg/g及以上的大量白蛋白尿组18例。另外收集21名健康体检者尿标本作为对照组。Ficoll法分离外周血单个核细胞,PBS调整单个核细胞浓度为200×106/L,于37℃与-70℃反复冻融4次,裂解细胞,采用一期凝固法在STAGO全自动凝血仪上测定外周血单个核细胞TF-PCA, ELISA法检测单个核细胞裂解液、尿液TF抗原含量。常规检测所有参与者空腹血糖、糖化血红蛋白、超敏CRP(Hs-CRP)、尿酸(UA)、胱抑素C (CYSC),以Macisaac公式估算肾小球滤过率(eGFR)。比较外周血单个核细胞TF-PCA、TF含量及尿液TF含量在各组间的差异,并分析TF与这些临床检测指标的相关性。2.尿液TF-PCA活性检测方法的建立与评价在STAGO全自动凝血仪上编程并作为检测设备,采用一期凝固法检测尿TF-PCA活性。分析该检测方法中混合血浆来源、混合血浆放置时间,不同稀释液稀释处理、标本储存不同时间等条件改变对尿液TF-PCA测定的影响；并对该检测方法的性能：精密度、准确度、最低检测限和线性范围进行方法学评价。3.尿液TF—PCA的测定在糖尿病肾病中的应用采用自建的一期凝固法测定2型糖尿病患者尿液TF-PCA. ELISA法检测尿液肾损伤标志物：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)、肾损伤分子-1(kidney injury molecule 1, KIM-1)、Smadl (drosophila mothers against decapentaplegic protein 1, smad1),以Macisaac公式估算肾小球滤过率(eGFR),常规方法检测空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(glycohemoglobin, HbAlc)、超敏CRP (Hs-CRP)、尿酸(UA)、血脂(包括TG、CHOL、HDL-C、LDL-C)、胱抑素C (CysC)、NAG等指标,以Macisaac公式确定肾小球滤过率(GFR)。分组方法同第一部分。分析各组间尿液TF抗原含量、TF-PCA的差异,及其与肾损伤标志物的相关性。采用ROC曲线确定尿液TF-PCA对DM早期肾损伤的诊断价值。结果1.2型糖尿病肾病患者组织因子检测与正常对照组相比,糖尿病患者外周血单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量,尿液TF含量均显著升高；在糖尿病患者三组之间,除正常蛋白组、微量蛋白组两组间无差异外(P>0.05),其余各组间均差异显著(P<0.05),在大量蛋白尿组升高最为明显,且大量蛋白尿组与肾小球滤过率成负相关,与UACR成正相关。临床研究结果表明,所有2型糖尿病患者单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量分别与下列临床指标相关,相关系数分别为：空腹血糖(r=0.263, r=0.393)、Hs-CRP (r=0.498, r=0.367)、HbAlc (r=0.225, r=0.298)、UACR (r=0.370, r=0.272)、UA (r=0.278, r=0.324);而尿液TF抗原含量则与Hs-CRP (r=0.288)、UACR(r=0.332)正相关。2.尿液TF-PCA活性检测方法的建立与评价混合血浆对TF-PCA活性的影响：取5人次正常混合血浆标本进行检测,发现混合血浆对测定结果并无显著影响。混合血浆2℃～8℃放置不同时间对测定结果的影响较大,随着混合血浆放置时间的延长,测定PCA凝固时间出现延长,8小时后显著高于即刻(0点),而在4小时内使用对测定结果无明显影响。尿液TF-PCA检测影响因素分析：以5份不同尿液标本观察不同稀释液对TF-PCA检测的影响,结果owren-koller (STAGO公司配套稀释液)稀释后5份标本凝固时间为197.2±28.6sec,显著低于生理盐水217.0±36.6sec和去离子水231.4±41.8sec结果,表明owren-koller稀释液更适合TF-PCA活性的检测。TF-PCA测定方法学评价：总不精密度分别为6.98%、5.49%,表明该方法重复性尚可,平均回收率分别为80.8%,最低检测限为5mu/L,并在15-2200 mu/L之间线性良好。3.尿液TF-PCA的测定在糖尿病肾病中的应用与正常对照组相比,糖尿病患者尿中TF-PCA均显著升高,且糖尿病患者三组间差异显著(P<0.05),在大量蛋白尿组升高最为明显。临床研究结果表明,所有2型糖尿病患者尿液TF-PCA与下列临床指标相关,相关系数为：BUN(r=0.242, P=0.025、CRE(r=0.392, P<0.001), CYSC (r=0.240, P=0.026)、hs-CRP(r=0.257,P=0.017).UACR(r=0.430,P<0.001),NGAL(r=0.280,P=0.009), smadl(r=0.284, P=0.008), eGFR (r=-0.458, P<0.01),与其它测定指标如血脂无相关性。ROC曲线分析表明尿液TF-PCA对糖尿病肾损伤具有一定的诊断价值(AUC=0.847)。结论1.本研究显示2型糖尿病患者外周单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量,尿液TF抗原含量显著升高,说明糖尿病患者处于高凝状态；TF的高表达参与DN的病理进程。2.成功建立一期凝固法检测血液及尿液TF-PCA,初步探讨该方法的影响因素,为尿液TF-PCA的深入研究提供依据。3.2型糖尿病患者尿液TF-PCA、TF抗原均显著升高,尿液TF-PCA与UACR正相关,与GRF负相关,尿液TF-PCA检测具有潜在的临床应用价值。主要创新点1.首次观察了DM患者外周血单个核细胞TF-PCA的变化,初步探讨了DM患者高凝状态在DN病理进程中的改变。2.成功建立了一期凝固法检测尿液TF-PCA,并对该方法的临床应用进行初步方法学评价。3.检测了DM患者尿液中TF-PCA活性及TF抗原含量,探讨其与肾小球、肾小管损伤标志物的关系及临床应用价值。