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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见严重并发症之一,可引起眼底特异性改变,居24岁至65岁人群致盲性眼病首位。根据视网膜新生血管是否出现,DR分为非增殖性(也称单纯型或背景型)糖尿病视网膜病变(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR),一旦进入PDR阶段,便会对视功能构成严重威胁。研究显示,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和Roundabout homolog 4(Robo4)是DR发生发展过程中两个重要调控因子,VEGF可以改变视网膜细胞和毛细血管内皮细胞之间相互作用,导致毛细血管通透性增高、血栓形成以及新生血管形成,引起视网膜渗出、出血、水肿,加速DR发生;Robo4在血管新生活跃区域附近的血管内皮细胞表达增加,在正常生理条件下可以通过抑制VEGF信号通路维持血管内平衡,在高糖条件下,VEGF与Robo4的表达水平同时上调,相互协同促进DR的发生发展。因此,研究VEGF和Robo4的信号通路及调控机制对有效控制DR的发生发展尤其关键。在本课题中,我们首先探讨了VEGF和Robo4在DR患者的纤维血管膜(fibrovascular membrane,FVM)中以及在链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型视网膜中表达的情况,预测两者在DR发生发展过程中作用的相关性。本课题从人体组织标本、细胞、动物模型三个层面进行实验验证:(1)将13例PDR患者的纤维血管膜组织标本作为研究对象,通过HE染色分析PDR患者纤维血管膜的组织结构,结果显示PDR发生伴随着新生血管的形成,初期阶段只有少量纤维组织生成,随着病程进一步发展,新生血管和纤维组织不断增多,进而形成纤维血管膜,后期血管发生退行,纤维组织大量生成;免疫荧光共聚焦显微镜观察发现,在纤维血管膜中VEGF和Robo4存在共定位的现象,提示在PDR的发生发展过程中,VEGF和Robo4共同发挥作用。(2)为了解VEGF和Robo4在DR发生发展过程中细胞水平的表达情况,在高糖条件下培养视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用RT-PCR和Western-Blot法检测高糖条件下VEGF和Robo4的miRNA在转录水平和蛋白水平表达情况。结果表明,高糖促进VEGF在转录水平和蛋白水平的表达,抑制Robo4在转录水平和蛋白水平的表达。(3)为了在动物模型中检测VEGF和Robo4在DR发生发展过程中的表达情况,本实验利用STZ诱导建立糖尿病大鼠模型,采用Western-Blot法检测糖尿病大鼠视网膜VEGF和Robo4蛋白表达情况。结果表明,糖尿病大鼠饲养4-8周后,视网膜VEGF和Robo4蛋白表达均较正常对照组增高,差异有统计学意义。以上研究提示,在DR发生发展过程中VEGF和Robo4相互作用:(1)在正常生理下,Robo4抑制VEGF的表达,进而抑制DR的发生发展;(2)在高糖条件下,Robo4表达降低,对VEGF的抑制作用减弱,导致VEGF表达增加,进而促进视网膜病变的发生发展;(3)在视网膜病变过程中,Robo4和VEGF表达增加,协同加速病变进程。miRNA以多种方式参与DR进展:(1)直接与基因启动子区域结合;(2)结合到靶基因的3’-非翻译区,引起转录后沉默、翻译抑制或RNA降解;(3)与转录因子和调节基因转录结合导致染色质的表观遗传修饰。研究miRNA在PDR患者中的表达水平,对于筛选靶向miRNA治疗PDR至关重要。因此,我们分析了视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞miRNA在高糖条件下的表达情况,筛选同时与VEGF和Robo4相互作用的miRNA,在糖尿病大鼠模型中探讨miRNA用于治疗DR的可能性。(1)体外模拟DR高糖环境,培养视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用RT-PCR研究视网膜细胞在高糖条件下miRNA-15家族表达情况。结果表明,在高糖条件下,视网膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞中miRNA-15a、miRNA-16、miRNA-424表达水平均降低,miRNA-195和miRNA-497表达水平均升高。(2)利用软件预测miRNA-15家族中的miRNA-15a和miRNA-195可以同时作用于VEGF和Robo4。选取miRNA-15a作为研究对象,验证其对VEGF和Robo4的靶向作用,并将miRNA-15a agomir注射到STZ诱导的糖尿病大鼠玻璃体内,Western-Blot检测VEGF和Robo4蛋白表达情况。实验结果表明,miRNA-15a靶向结合VEGF和Robo4,在糖尿病大鼠视网膜内,miRNA-15a agomir同时抑制VEGF和Robo4的表达,miRNA-15a可以作为治疗PDR的研究靶点。综上所述,我们得出结论,VEGF和Robo4在促进PDR病程发展过程中均起到推动作用,进一步筛选的在糖尿病视网膜病变过程中参与调控VEGF与Robo4的miRNA,具有作为DR生物治疗靶点的可能性。本课题的研究结果不仅有助于对DR进展机制的理解,而且为鉴定DR患者潜在有效的生物治疗靶点提供理论支持,并推动miRNA成为生物治疗靶点的研发及临床应用。