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传统的乙醇是利用粮食通过高温蒸煮发酵的方法生产,考虑到传统酒精发酵工业高能耗、原料缺乏、高污染、发酵酒精度偏低等弊端。本实验选择了以马铃薯淀粉为发酵原料,生产乙醇符合国家节能减排的产业政策。利用基因操作技术克隆了马铃薯来源的α-淀粉酶基因以及具有黑曲霉来源的耐酸耐高温γ-淀粉酶基因,经体外构建后分别导入酵母菌,获得了可有效降解马铃薯淀粉的转基因毕赤酵母工程菌,通过接种酿酒酵母厌氧发酵获得乙醇。实验主要研究结果如下：1、以夏波蒂马铃薯总RNA为模板,根据α-淀粉酶基因保守区序列设计合成了引物,通过RT-PCR法获得α-淀粉酶基因(amyA),利用平末端克隆技术将其克隆至pET32a上进行测序,测序结果表明该基因全长1224 bp,编码406个氨基酸。通过生物信息学分析54-1224bp为编码成熟肽基因,又设计了引物克隆获得成熟肽基因(Namy),同时将其亚克隆至pPIC9k,构建重组表达质粒pkamyA转化毕赤酵母GS115,利用锥虫蓝法筛选获得高表达淀粉酶活性菌株GSamyA5,对该菌株进行培养,0.5%(v/v)甲醇诱导表达72h,利用SDS-PAGE电泳分析表达上清液,发现GSamyA5表达的特异蛋白条带,约为42kDa。对重组粗酶酶学性质分析表明：该酶作用的最适pH值为6.0,最适作用温度为45℃,热稳定性及抗酸碱性较差,该酶对金属离子无依赖性。2、以黑曲霉总RNA为模板,根据γ-淀粉酶基因保守区序列设计合成了引物,通过RT-PCR法获得γ-淀粉酶基因(amyC),利用平末端克隆技术将其克隆至pET32a上进行测序,测序结果表明该基因全长1996bp,编码604个氨基酸。同时将其亚克隆至pPIC9k,构建重组表达质粒pkamyC转化毕赤酵母GS115,利用锥虫蓝法筛选获得高表达淀粉酶活性菌株GSamyC3,对该菌株进行培养,0.5%(v/v)甲醇诱导表达72h,利用SDS-PAGE电泳分析表达上清液,发现GSamyC3表达的特异蛋白条带,约为62kDa。对重组粗酶酶学性质分析表明：该酶作用的最适pH值为4.6,最适作用温度为60℃,热稳定性及抗酸碱性良好,该酶对金属离子无依赖性。3、以马铃薯淀粉为原料,按1%接种量分别接种转α-淀粉酶基因和γ-淀粉酶基因酵母工程菌,甲醇诱导表达36h后二次接种转γ-淀粉酶基因酵母菌,再添加5%酿酒酵母进行厌氧发酵,生产酒精。考察了不同发酵时间、发酵温度及接种量对马铃薯淀粉出酒率及水解率的影响,得出该发酵工艺最适条件为：接种量为5%,最适温度为30℃,发酵时间为72小时；产酒率分别为9.6%,7.77%,9.75%。