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Leafy Cotyledon (LEC)基因是植物胚胎发育关键基因,LEC基因包括LEC1、LEC2两个基因。在胚胎形态发生阶段,LEC基因决定胚柄细胞命运、控制子叶特性,在后期胚胎成熟阶段,LEC基因促进储藏物质的积累及胚抗脱水性的获得。LEC基因也是体细胞胚胎发生的关键调控基因,能够促进体细胞向胚性细胞的转变。体细胞胚胎发生是植物在离体诱导条件下,体细胞转变为胚性细胞,随后经历一系列形态和生化变化最终形成体细胞胚的过程。是植物细胞全能性的体现。许多作物的离体再生频率低,是进行基因工程改良的限制因素。提高作物离体再生频率,如提高作物体细胞胚发生的频率,建立高效作物离体再生体系是利用基因工程改良作物的前提,特别是对于那些难于再生的作物,如大豆、棉花、花生等作物具有更重要的意义。LEC基因被证明在拟南芥中具有促进体细胞胚发生的功能。由于组成型表达LEC基因无法完成正常的生活周期,本实验构建了包含35S:AtLEC:GR嵌合基因的诱导型表达载体转化烟草,用DEX(地塞米松)处理,AtLEC基因能够被诱导表达。通过拟南芥LEC基因的过量表达,促进了烟草体细胞向胚性细胞的转变,产生了体细胞胚结构,在烟草中验证了LEC基因促进体细胞胚胎形成的作用。并建立了高效的植物离体再生体系,为进一步转化棉花等作物做准备。本实验主要研究结果如下：(1)诱导表达载体的构建和烟草转化：分别构建LEC1和LEC2诱导表达载体pCAMBIA2300-AtLEC1：GR、pART-AtLEC2：GR，通过农杆菌介导法侵染烟草叶片,经共培养、抗性筛选和生根培养等步骤分别获得19株和16株再生植株,经PCR验证全部为转基因植株。并通过自交和抗性筛选,分别得到5株LECl和7株LEC2转基因烟草纯合体株系。(2)地塞米松(DEX)诱导胚性愈伤和体细胞胚胎形成：在转基因烟草种子萌发过程中加入DEX诱导。结果LEC1转基因烟草幼苗呈现愈伤化,子叶肥厚,不能正常伸展,但没有胚胎类似结构产生；LEC2转基因烟草幼苗在芽顶端分生组织处形成胚性愈伤,随着诱导时间的增长,胚性愈伤上有体细胞胚产生,且能够继续生长发育成芽。通过调整DEX诱导的时间和浓度,获得了高效的再生体系。用含有5μM、10μM DEX的MS培养基培养LEC2转基因烟草种子20d,将形成的愈伤组织在MS0上进行再生,再生率为100%,且再生芽在较短的时间内就可长成独立的植株。(3)LEC2对转基因植物中内源激素的影响：利用HPLC方法对DEX诱导不同阶段的LEC2转基因材料及野生型材料内源激素进行测定,结果表明,经DEX诱导20d的LEC2转基因烟草胚性愈伤和诱导后在MS0培养基上再生20d的愈伤材料较野生型材料吲哚-3-乙酸(IAA)含量分别高2.87倍、5.27倍,玉米素(ZT)分别高1.25倍、6.21倍。(4)LEC基因表达对转基因植物基因表达的影响：对用30μM DEX诱导12d的LEC1转基因烟草及对照进行表达谱升级版测序,结果发现,胚胎发生相关基因MADS-box9、 SERK1、 LECl-Like及种子储藏物质LEA蛋白、油脂蛋白(oleosin)、油体钙蛋白(caleosin)、7S、11S球蛋白(globulins)和豌豆球蛋白(vicilins)等基因表达明显上调。与花发育相关和胚胎发生直接相关的生长素相关基因ARF3、ARF8、ARF5、PIN1表达水平也有不同程度提高,而对体胚发生起抑制作用的乙烯途径相关基因ACO等表达水平则降低。对用30μM DEX诱导20d的LEC2转基因烟草及对照进行表达谱升级版测序分析,发现胚胎发生相关基因MADS-box9、 SERK1、 LEC1-Like基因及种子后期储藏物质积累相关基因LEA蛋白、油脂蛋白(oleosin)、油体钙蛋白(caleosin)、7S、11S球蛋白(globulins)和豌豆球蛋白(vicilins)等表达量升高。与花发育相关和胚胎发生直接相关的生长素相关基因ARF8、ARF5、PIN1、PIN2表达水平明显上升。而对生长素信号起抑制作用的IAA13表达量减少。LEC2基因的表达还降低了GA合成基因GA3ox2的表达。说明LEC2基因促进转基因植物体细胞胚发生可能通过胚胎发生相关基因和植物激素起作用。(5)烟草胚胎发生相关基因的克隆及半定量RT-PCR分析：利用同源克隆方法,选择相近物种中基因的保守序列片段设计引物,以烟草cDNA为模板进行克隆,得到多个烟草胚胎发生相关基因。对其进行半定量RT-PCR分析,结果显示,胚胎发生相关基因AGL15、WOX2、ABI3在DEX诱导转基因烟草形成的胚性愈伤中特异表达；种子储藏蛋白基因如SUS2在DEX诱导转基因烟草形成的胚性愈伤和野生烟草叶片在激素培养基上形成的愈伤组织中都有表达。