李PsMYB-75的功能鉴定及李花芽萌动前后差异基因筛选

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李(Prunus salicina Lindl.)是蔷薇科李属植物,为我国广泛栽培的落叶果树。李原产长江流域,其完成正常花芽分化都需要700-1000h(≤7.2℃)冷量;广东属于南亚热带气候,是其南缘栽培区,经长期自然选择和人工选择,在广东已演化形成了一个需冷量很低的南亚热带特色品种群。广东李果实色泽多样,包括红皮红肉的三华李、红皮黄肉的早李和绿皮黄绿肉南华李等3个类型。色泽是果实品质的一项重要经济指标,果实颜色的形成一般是有色素类物质的产生,果实中花青苷合成是果实红色产生的主要原因。研究者发现,MYB转录因子是调控花青苷合成的有效转录因子。本实验以红皮红肉的‘从化三华李’和红皮黄肉的‘三月李’为实验材料,对其果实花青苷合成相关转录因子Ps MYB-75功能进行验证;并利用‘从化三华李’和‘三月李’花芽萌动前后的转录组数据,进行了差异基因的筛选。(1)以‘从化三华李’的c DNA为模板克隆Ps MYB-75并对Ps MYB-75进行生物信息学分析,经ORF finder、Ex PAsy、Promoter等软件分析显示,Ps MYB-75最大ORF为732bp,共编码243个氨基酸,分子质量约为283,87.89,理论等电点为6.91,原子数为393.5;其蛋白质序列中占比最高氨基酸为Leu,所占比例为9.9%;占比最低氨基酸为His所占比例为1.6%;蛋白质不稳定指数为49.17;通过对其蛋白进行疏水性预测,发现该蛋白为亲水性蛋白。对Ps MYB-75氨基酸序列与其余13个物种MYB基因的蛋白序列进行多重比较建立系统进化树,发现其在聚类上和杏的亲缘关系最近。(2)对‘从化三华李’果实中Ps MYB-75进行沉默处理后的结果显示:其成熟果实着色表现出缺陷,花青苷合成受阻,花青苷合成相关结构基因F3’H、UFGT、ANS\LDOX随Ps MYB-75沉默表达量显著降低。亚细胞定位实验结果表明Ps MYB-75定位在细胞核。转录自激活实验证实Ps MYB-75是转录激活因子。用Gateway技术构建Ps MYB-75过表达载体,以叶盘转化法转化K362烟草叶片,转基因烟草苗出现叶片变红的现象。(3)以‘从化三华李’、‘三月李’萌动花芽和未萌动花芽为材料,利用RNAseq技术对花芽进行测序,对测序结果进行分析,结果显示,每个时期处理的样品Clean Data均达到6.33Gb,Q30碱基百分比在92.94%及以上,分别将各样品的Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对,比对效率从90.91%到95.48%不等。对差异基因进行分析并对差异基因进行KEGG数据库中比对,‘三月李’萌动花芽与未萌动花芽这一比较组合中差异显著性基因主要富集在内质网蛋白加工途径。‘从化三华李’萌动花芽与未萌动花芽比对,差异显著基因主要富集在生物合成途径、光合作用途径、玉米素生物合成途径、角质、亚氨酸和蜡生物合成途径等。‘三月李’秋花萌动花芽与未萌动花芽比对,差异显著基因主要富集在糖代谢、植物激素信号传导、苯丙素生物合成和光合作用等途径。
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