论文部分内容阅读
背景与研究目的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现及体外培养,为研究神经系统发育及中枢神经系统疾病和损伤的治疗提供了新的思路和方法。NSCs是具有多向分化潜能、自我复制、高度增殖能力等特点的多能干细胞,并能分化为特定类型神经元和神经胶质细胞。目前,关于NSCs的研究很多,但离临床应用尚有很大距离。新近研究表明,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后,在损伤局部移植NSCs能促进成年动物模型的功能恢复,但移植的NSCs主要分化为胶质细胞,形成胶质瘢痕,阻碍了神经功能进一步恢复,因此,探讨NSCs准确定向分化为神经元的机制和技术成为脊髓损伤研究的热点。NSCs的增殖分化受到自身基因及外来信号的共同作用。Wnt/β-catenin信号通路在神经系统发育中起重要作用,其与自身基因如bHLH、Notch信号通路及外来信号如TGF-β超家族成员(如骨形态发生蛋白)、神经营养因子、细胞因子和化学物质(如维甲酸)等众多因素的共同作用,促进了神经的发育。研究表明,维甲酸能促进NSCs向神经元定向分化,并与Wnt/β-catenin信号通路及其他信号间存在相互联系,但机制有待进一步研究。本课题探讨全反式维甲酸(ATRA)干预下,Wnt/β-catenin信号通路在鼠胚NSCs向神经元定向分化中的作用及与其他信号因子的相互关系。方法1.采用1×104/ml、1×105/ml、1×106/ml及1×107/ml接种密度体外培养鼠胚NSCs,观察细胞生长情况,MTT法检测各密度培养的NSCs在不同时间点对细胞的增殖效应,并绘制生长曲线;利用不同的传代方法观察亚代克隆的活性和增殖能力;使用免疫荧光染色法对神经干细胞及其分化细胞进行鉴定。选择体外最佳的NSCs培养密度及传代方法;2.选用0.5gmol/L、1.0μmol/L、5.0/μmol/L、10.0μmol/L浓度的ATRA体外培养NSCs,使用BrdU免疫荧光染色,计数阳性细胞,对比分析各组对细胞增殖效应;通过免疫荧光双标技术和流式细胞仪检测技术检测各组细胞分化为神经元的能力,探索促神经元分化的最佳ATRA浓度;3.使用实时荧光定量RT-PCR和蛋白印迹(Westem-Blot)分别检测未干预及干预后3d、5d、7d、9d分化细胞的β-catenin、CyclinDl、Axin、Wnt-1、Notch1、BMP2的mRNA水平及蛋白表达水平;免疫细胞化学染色后,观察细胞内各时间点β-catenin、CyclinDl、Wnt-1、Notch1、BMP2的表达及变化情况,探讨ATRA干预下,鼠胚NSCs分化为神经元过程中,不同时间点的Wnt/β-catenin信号途径及其相关信号因子的表达和相互作用。结果1.从胚胎大鼠脑皮层成功分离培养出NSCs,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能,发现当NSCs接种密度为1×10~6/ml时,细胞增殖速度最快,克隆球生成数量最多;2.含有ATRA的完全培养基可促进NSCs增殖,各组间比较无明显差别,但增殖能力明显弱于完全培养基中培养的NSCs;1.0μmol/L的ATRA促神经元分化比例最高,无ATRA的完全培养基中细胞主要分化为GFAP阳性的星形胶质细胞;3.ATRA在促NSCs分化中,Wnt-1在细胞分化早期表达明显增高,激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制β-catenin降解复合物重要成分Axin表达,促使β-catenin在细胞浆和细胞核表达增加,并增加靶基因CyclinDl转录;同时,抑制了Notch1和BMP2蛋白的表达,表明,ATRA促神经元分化的效应可能与Wng/β-catenin信号通路激活有关,并同时抑制Notch1及BMP2表达。结论1.鼠胚NSCs细胞在体外可不断增殖及传代,1×10~6/ml接种密度是促进NSCs增殖的最佳密度:2.ATRA可促使NSCs增殖及分化,促增殖效应弱于完全培养基,但能显著促NSCs分化为神经元,其中,1.0μmol/L浓度是促神经元分化的最佳浓度;3.ATRA促神经元分化作用可能与激活Wng/β-catenin信号通路,促使β-catenin在胞浆内及胞核内表达,激活了wnt信号的相关靶基因的转录,同时抑制Norch1和BMP2表达有关。