研究背景肾纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾病的常见病理学途径,其特征主要包括肾小管萎缩,炎性细胞的积累,纤维母细胞/肌成纤维细胞激活,细胞外基质(ECM)的积累和异常重塑,如I型胶原(Col-I)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)和纤连蛋白(FN)。此外,上皮-间质转化(EMT)与肾纤维化的发病机制和进展密切相关。据报道,肾纤维化与肾功能的下降密切相关,是最重要的预后指标。预防肾纤维化可能是缓解或甚至逆转慢性肾脏疾病的有效治疗方法。然而,肾纤维化的病因是复杂的,目前没有有效的药物可用于治疗其进展。其发生和发展的病理生理机制尚不清楚,仍需要研究。EMT被认为是上皮细胞失去顶端基极性的过程,并获得间质细胞的迁移和侵袭性质。报告指出,这些细胞的生物标志物随时间呈现变化,包括上皮细胞标记蛋白E-钙粘蛋白的丧失,间充质特征如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的获得以及间质基质蛋白的产生,如纤连蛋白和胶原。此外,许多生长因子以各种方式介导EMT,如细胞因子,激素和细胞外信号。报告显示病理状态下的EMT,ECM积累和肾纤维化进展主要通过转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路介导。TGF-β1与其受体结合,可与Smad2,Smad3和Smad4形成复合物。该复合体从细胞质转移到细胞核,并调节各种靶基因表达,如胶原。但是,smad7是TGF-β1信号传导的负反馈环的一部分。N-Myc下游调控基因-2(NDRG2)是NDRG家族的成员,其中包括四个成员NDRG1-4。NDRG2调节细胞分化和细胞增殖在不同的组织,如脑,心脏,肝脏和肾脏)。报告显示,作为肿瘤抑制因子的NDRG2抑制乳腺癌中的EMT和胆囊癌。此外,NDRG2通过抑制大鼠的TGF-β1/Smad通路来改善肝纤维化。据报道,与肾细胞癌相比,NDRG2在正常肾近端肾小管细胞中显着上调,可以抑制肾癌细胞的增殖。然而,NDRG2在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞中的功能尚未被研究。研究目的(一)分别采用实时荧光定量PCR法和Western Blotting法检测NDRG2在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞系的表达水平。(二)构建三种NDRG2诱导的HK-2细胞亚系及其对照组,采用Western Blotting法和实时荧光定量PCR法检测EMT标记物在不同HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的表达水平;采用ELISA法和实时荧光定量PCR法检测在不同HK-2细胞亚系中细胞外基质的表达水平。(三)构建三种NDRG2诱导的HK-2细胞亚系及其对照组,采用Western Blotting法检测Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7在不同细胞亚系中的表达水平;采用Western Blotting法和实时荧光定量PCR法检测在NDRG2-siRNA+SIS3(SelleckChem)作用下EMT标记物的蛋白和mRNA的表达水平及ELISA法和实时荧光定量PCR法检测细胞外基质的表达水平。材料与方法1.1 HK-2细胞系:一种永生化的人肾近端肾小管细胞系,购自美国ATCC(American Type Culture Collection,VA,USA)。1.2实验方法:将不同浓度的TGF-β1(0ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)分别加入到HK-2细胞系中,分别进行细胞培养48h后,采用实时荧光定量PCR法和Western Blotting法检测NDRG2在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞系中的表达水平。建立三种NDRG2诱导的HK-2细胞亚系及其对照组,采用Western Blotting法和实时荧光定量PCR法检测EMT标记物在不同HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的表达水平;采用ELISA法和实时荧光定量PCR法检测在不同HK-2细胞亚系中细胞外基质的表达水平。建立三种NDRG2诱导的HK-2细胞亚系,采用Western Blotting法检测Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7(p-Smad7)在不同细胞亚系中的表达水平;采用Western Blotting法和实时荧光定量PCR法检测在NDRG2-siRNA+SIS3(SelleckChem)作用下EMT标记物的蛋白和mRNA的表达水平及ELISA法和实时荧光定量PCR法检测细胞外基质的表达水平。1.3统计学方法:测定结果以x±s表示,使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。采用Bonferroni事后检验的方法,用t检验或单因素方差分析(ANOVA)对所涉及的2组以上的数据进的比较。对RT-PCR各组数据采用单因素方差分析,以P<0.05差异为有统计学意义。结果(一)NDRG2在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞系中的表达及意义1.RT-PCR法检测NDRG2在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞系中mRNA的表达水平:NDRG2在A1(0ng/ml TGF-β1)、B1(2.5ng/ml TGF-β1)、C1(5ng/ml TGF-β1)、D1(10ng/ml TGF-β1)、E1(20ng/ml TGF-β1)HK-2细胞亚系中的mRNA表达水平依次降低;B1组、C1组、D1组及E1组与A1组相比较P值分别为0.012、0.011、0.003、0.016,C1组与B1组相比较P=0.031,D1组与C1组相比较P=0.013,E1组与D1组相比较P=0.013,差异均具有统计学意义。2.Western blot法检测NDRG2在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞系中蛋白的表达水平:NDRG2在A2(0ng/ml TGF-β1)、B2(2.5ng/ml TGF-β1)、C2(5ng/ml TGF-β1)、D2(10ng/ml TGF-β1)、E2(20ng/ml TGF-β1)HK-2细胞亚系中的蛋白表达水平依次降低;B2组、C2组、D2组及E2组与A2组相比较P值分别为0.011、0.001、0.004、0.017,C2组与B2组相比较P=0.021,D2组与C2组相比较P=0.014,E2组与D2组相比较P=0.003,差异均具有统计学意义。(二)NDRG2和TGF-β1对EMT标记物及细胞外基质的影响及意义1.通过细胞培养及转染技术构建TGF-β1+pcDNA3.1-NDRG2 HK-2细胞亚系及其对照组TGF-β1+pc-control、TGF-β1+NDRG2-siRNA HK-2细胞亚系及其对照组TGF-β1+si-NC、TGF-β1 HK-2细胞亚系及其对照组control,然后通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各HK-2细胞亚系中细胞活性,结果各HK-2细胞亚系与其对照组相比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明各细胞系的细胞活力均不受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN、TGF-β1及相应对照剂的影响。2.Western blot法检测NDRG2在接受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN转染的HK-2细胞亚系中蛋白表达水平:NDRG2在只含有TGF-β1(B1组/B2组)的HK-2细胞亚系中的相对表达量与对照组control(A1组/A2组)相比较明显降低(P=0.011;P=0.009);NDRG2在接受pcDNA3.1-NDRG2(D1组)转染的HK-2细胞亚系中的相对表达量与对照组pc-control(C1组)相比较明显升高(P=0.024);NDRG2在接受NDRG2-siRNA(F1组)转染的HK-2细胞亚系中的相对表达量与及对照组si-NC(E1组)相比较明显降低(P=0.001);上述差异均具有统计学意义。3.RT-PCR法和Western blot法分别检测EMT标记物(E-cadherin、a-SMA、Vimentin、Snail)在不同HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白的表达水平:E-cadherin只含有TGF-β1(B2组)的HK-2细胞亚系中的相对表达量与对照组control(A2组)相比较明显降低(P<0.05),而a-SMA、Vimentin、Snail的表达量与对照组相比较均明显升高(P<0.05);E-cadherin在接受pcDNA3.1-NDRG2(D2组)转染的HK-2细胞亚系中的相对表达量与对照组pc-control(C2组)相比较明显升高(P<0.05),而a-SMA、Vimentin、Snail的表达量与对照组相比较均明显降低(P<0.05);E-cadherin在接受NDRG2-siRNA(F2组)转染的HK-2细胞亚系中的相对表达量与及对照组si-NC(E2组)相比较明显降低(P<0.05),而a-SMA、Vimentin、Snail的表达量与对照组相比较均明显升高(P<0.05);上述差异均具有统计学意义。4.ELISA法和RT-PCR法分别检测细胞外基质(COI-I、COI-III、FN)在不同HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的表达水平:COI-I、COI-III及FN蛋白在含有TGF-β1(B4组)的HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的相对表达量与对照组control(A4组)相比较均明显升高(P<0.05);D4组(TGF-β1+pcDNA3.1-NDRG2)与C4组(TGF-β1+pc-control)COI-I、COI-III、FN的蛋白和mRNA表达量则明显降低(P<0.05);F4组(TGF-β1+NDRG2-siRNA)与E4组(TGF-β1+si-NC)COI-I、COI-III、FN的蛋白和mRNA的表达量则明显升高(P<0.05)。上述差异均具有统计学意义。(三)NDRG2和TGF-β1在HK-2细胞系中对Smad表达的影响及意义1.Western blot法检测Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7在接受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN转染的HK-2细胞亚系中蛋白表达水平:t-Smad2及p-Smad2(磷酸化)在B1组(TGF-β1)的蛋白表达水平比对照组A1组(control)均明显上升(P=0.003、P=0.012),而在D1组(pcDNA3.1-NDRG2)及F1组(NDRG2-siRNA)分别与其对照组C1组(pc-control)、E1组(si-NC)相比其蛋白表达量均无明显差异(P=0.067及P=0.054、P=0.053及P=0.102);t-Smad3及p-Smad3在在B1组(TGF-β1)的蛋白表达水平比对照组A1组(control)明显上升(P=0.005、P=0.021),t-Smad3在D1组(pcDNA3.1-NDRG2)及F1组(NDRG2-si RNA)分别与其对照组C1组(pc-control)、E1组(si-NC)相比其蛋白表达量均无明显差异(P=0.112、P=0.215),p-Smad3在D1组(pcDNA3.1-NDRG2)与其对照组C1组(pc-control)相比其蛋白表达量明显降低(P=0.002),而在F1组(NDRG2-si RNA)与其对照组E1组(si-NC)相比其蛋白表达量明显升高(P=0.031);Smad7在B1组(TGF-β1)的蛋白表达水平比对照组A1组(control)均明显降低(P=0.011),而在D1组(pcDNA3.1-NDRG2)及F1组(NDRG2-siRNA)分别与其对照组C1组(pc-control)、E1组(si-NC)相比其蛋白表达量均无明显差异(P=0.098及P=0.154、P=0.353及P=0.202)。上述差异均具有统计学意义。2.Western blot法检测Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7在接受NDRG2-siRN(SIS3)转染的HK-2细胞亚系中蛋白表达水平:Smad2、p-Smad2、Smad3及Smad7在SIS组(NDRG2-siRNA+SIS3)的蛋白表达水平与TGF组(NDRG2-siRNA)相比均无明显差异(P=0.140、P=0.112、P=1.005、P=1.207);p-Smad3在SIS组(NDRG2-siRNA+SIS3)的蛋白表达水平与TGF组(NDRG2-siRNA)相比明显降低(P=0.015)。3.RT-PCR法和Western blot法分别检测EMT标记物(E-cadherin、a-SMA、Vimentin、Snail)在不同HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白的表达水平:E-cadherin、a-SMA、Vimentin、Snail在TGF-β1+si-NC(NC组)的HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白的相对表达量与只含有TGF-β1(Con组)相比较均无明显差异(P>0.05);E-cadherin在TGF-β1+NDRG2-si RNA(TGF组)HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白相对表达量与TGF-β1+si-NC(NC组)相比较明显降低(P<0.05),而a-SMA、Vimentin、Snail的mRNA和蛋白的表达量与对照组相比较均明显升高(P<0.05);E-cadherin在TGF-β1+NDRG2-siRNA+SIS3(SIS组)HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白的相对表达量与及对照组TGF-β1+NDRG2-siRNA(TGF组)相比较明显升高(P<0.05),而a-SMA、Vimentin、Snail的mRNA和蛋白的表达量与对照组相比较均明显降低(P<0.05);上述差异均具有统计学意义。4.ELISA法和RT-PCR法检测细胞外基质(COI-I、COI-III、FN)在不同HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的表达水平:COI-I、COI-III及FN蛋白在TGF-β1+si-NC(NC组)的HK-2细胞亚系中的蛋白和m RNA相对表达量与只含有TGF-β1(Con组)相比较均无明显差异(P<0.05);TGF组(TGF-β1+NDRG2-siRNA)与NC组(TGF-β1+si-NC)COI-I、COI-III、FN的蛋白和mRNA表达量则明显升高(P<0.05);SIS组(TGF-β1+NDRG2-siRNA+SIS3)与NC组(TGF-β1+si-NC)COI-I、COI-III、FN的蛋白和mRNA表达量则明显降低(P<0.05)。上述差异均具有统计学意义。结论NDRG2调节TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化的作用,且可能是通过TGF-β1/Smad3信号通路实现的。(一)NDRG2的mRNA和蛋白表达水平在不同浓度TGF-β1诱导的HK-2细胞中以剂量依赖性方式下调,特别是TGF-β1(>10ng/mL),其作用最大(P<0.05)。这些结果表明HK-2细胞中TGF-β1下调NDRG2 mRNA和蛋白表达,表明其可能对肾纤维化的抑制基因起调控作用。(二)根据E-cadherin、a-SMA、Vimentin、Snail在不同HK-2细胞亚系中的mRNA和蛋白的表达情况,揭示了在mRNA和蛋白水平,E-cadherin在只含有TGF-β1的HK-2细胞亚系及NDRG2-siRNA HK-2细胞亚系中表达量降低,在pcDNA3.1-NDRG2 HK-2细胞亚系中过表达,a-SMA、Vimentin、Snail在只含有TGF-β1的HK-2细胞亚系及NDRG2-siRNA HK-2细胞亚系中过表达,而在pcDNA3.1-NDRG2 HK-2细胞亚系中表达量降低,表明NDRG2调节TGF-β1诱导的HK-2细胞中EMT标记物的蛋白质和m RNA表达,在EMT过程中NDRG2/TGF-β1存在潜在的调节机制。(三)根据COI-I、COI-III、FN在不同HK-2细胞亚系中的蛋白和mRNA的表达水平,揭示了在mRNA和蛋白水平,COI-I、COI-III、FN在只含有TGF-β1的HK-2细胞亚系及NDRG2-siRNA HK-2细胞亚系中过表达,在pcDNA3.1-NDRG2 HK-2细胞亚系中表达量降低,表明NDRG2调节TGF-β1诱导的HK-2细胞中细胞外基质的分泌,在ECM过程中NDRG2/TGF-β1同样存在潜在的调节机制。(四)NDRG2可抑制Smad3在TGF-β1诱导的HK-2细胞中的磷酸化;NDRG2可调节TGF-β1诱导的HK-2细胞的纤维化,且可被Smad3磷酸化的特异性抑制剂(SIS3)部分逆转NDRG2的调节作用;NDRG2调节TGF-β1诱导的HK-2细胞中细胞外基质的分泌,且可被Smad3磷酸化的特异性抑制剂(SIS3)部分逆转NDRG2的调节作用;NDRG2调节TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化的作用,且可能是通过TGF-β1/Smad3信号通路实现的。若能够研发出增加NDRG2表达的基因药物或抑制TGF-β1/Smad3信号通路的药物,则在一定程度上可以延缓或终止肾纤维化的发生发展,进而缓解慢性肾脏病的发病率。