目的蛋白多糖(proteoglycans,PG)是机体一大类具有复杂结构的糖基化大分子物质,由核心蛋白(core protein)和连接其上的氨基聚糖侧链(glocosaminoglycan,GAGs)构成,是细胞外间质的主要组成成份。PG对机体的多种生理过程起重要的调控作用;在细胞外基质的合成与沉积、细胞膜信号传导、正常细胞和肿瘤细胞的生长、细胞粘附和运动、细胞分化、形态发生以及病毒感染等过程中起关键作用。对于PG在肿瘤发生发展中作用的研究,已成为越来越多的学者关注的热点。人木糖基转移酶-I(xylosyltransferase,XT-I)催化机体PG生物合成的起始阶段,将木糖基从尿苷二磷酸-木糖(UDP-xyloside)连接到核心蛋白的丝氨酸-甘氨酸序列的丝氨酸残基的羟基上,并以此开始GAGs侧链的生物合成。XT-I是PG的合成中的效率-限制步骤(rate-limited step)中的关键起始酶,对PG的生物合成至关重要。XT-I的活性被认为是机体PG水平的真实反映,2006年XT-I的表达水平被确定为PG代谢异常类疾病的临床诊断生化指标(diagnostic biochemical marker)。XT-I与人类健康与疾病的关系日益受到人们的关注。涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一,约占涎腺肿瘤的10%,恶性涎腺肿瘤的30%。可发生于任何年龄,以40-60岁多见。SACC易局部复发和远隔器官转移,以肺部转移最为多见。SACC主要由导管上皮细胞和肿瘤性肌上皮细胞(neoplastic myoepithelial cells,NMCs)构成。在涎腺肿瘤中,NMCs具有分泌产生PG,形成细胞外间质的功能。SACC是以NMCs增生为主的涎腺肿瘤,在其组织结构的筛孔内和条索周围都充满了由NMCs分泌产生的富含PG的细胞外基质物质,为SACC细胞的分化、增殖、浸润和转移等生物学行为,提供了必不可少的微环境,研究认为:SACC的生物学行为与其异常分泌的细胞外基质密切相关,但作为细胞外基质重要组成成分的PG对SACC的作用与影响尚不明确。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是迄今为止最有效的基因阻断技术,可以特异、高效地沉默特定基因的表达,抑制靶基因的转录产物,下调相应基因的蛋白。大量的研究已证实:应用RNAi技术可以显著抑制肿瘤细胞的异常增殖、生长和侵袭与转移。这些成果为RNAi技术应用于涎腺肿瘤的基因功能研究和新的治疗方法的探求提供了良好的依据。本课题以人涎腺腺样囊性癌肺高转移株ACC-M细胞为研究模型,采用RNAi技术沉默人XT-I基因,阻抑ACC-M细胞中PG的生物合成,观察PG分泌减少对ACC-M细胞生长及生物学特性的影响,探讨PG在SACC发生发展中的意义,为今后应用RNAi技术治疗涎腺肿瘤提供新思路。方法1、制备及鉴定抗人木糖基转移酶(XT-I)蛋白多克隆抗体分析选择人XT-I蛋白的优势抗原表位,PCR扩增相应区域DNA片段,插入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌ER2566,获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体,间接ELISA法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体,Western blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。2、构建靶向抑制人XT-I基因的shRNA真核表达载体根据siRNA设计原则,设计短链寡核苷酸,化学合成双链DNA片段,克隆到pGenesil-1载体中,构建靶向人XT-I基因的shRNA真核表达载体shRNAWJ3和shRNAWJ4,同时设计合成一条不针对人类任何基因的阴性对照质粒;构建的质粒分别进行酶切及核酸测序鉴定。3、XT-I基因沉默效果的测定及稳定阻抑PG合成的细胞株的建立将shRNA真核表达载体通过脂质体法转染ACC-M细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并计数转染效率。浓度为500μg/ml的G418筛选获得稳定表达shRNA的细胞株:ACC-M-WJ3、ACC-M-WJ4和阴性对照ACC-M-HK;采用Real-Time PCR和Western blot检测RNAi后细胞XT-I的表达;生物染色法检测细胞合成分泌PG的变化。4、阻抑PG的合成分泌对ACC-M细胞增殖的影响选择三组细胞:ACC-M-WJ3细胞(实验组)、ACC-M细胞(空白对照组)和ACC-M-HK细胞(阴性对照组)进行细胞增殖特性的检测。采用细胞生长曲线测定(细胞计数法、MTT法)、克隆形成试验、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,观察阻抑PG的合成与分泌对ACC-M细胞体外增殖的影响。裸鼠皮下移植瘤试验:15只4周龄雌性BALB/C-nu裸鼠,体重16-17g,随机分为三组,分别注射ACC-M-WJ3细胞、ACC-M细胞和ACC-M-HK细胞于裸鼠左前背部皮下,每只裸鼠注射细胞2×106个/0.2ml。观察各组移植瘤增殖情况,于接种后第28天处死裸鼠,测量比较各组移植瘤瘤体体积、称量瘤重,计算抑瘤率。移植瘤组织常规固定、包埋,制作病理切片,HE染色观察组织学变化。5、阻抑PG合成分泌对ACC-M细胞侵袭转移特性的影响选择三组细胞:ACC-M-WJ4、ACC-M(空白对照组)和ACC-M-HK(阴性对照)进行细胞侵袭转移特性的研究。粘附试验:将各组细胞以1×104/100μl/孔分别接种于包被BSA和Matrigel的96孔培养板,常规培养1h后,MTT法检测其490nm吸光值,计算粘附率。划痕试验:将三组细胞接种于6孔培养板,培养至细胞铺满形成细胞单层。用10μl移液器tip头划痕单层培养细胞,照相记录初始划痕区相对距离。PBS清洗两次,更换含10g/L BSA和1% FBS的DMEM培养液,培养24h后换成10% FBS的DMEM培养液,于培养后12h,倒置显微镜下计数各组越过划痕边缘向空白处运动生长的细胞数及划痕愈合时间。侵袭实验:将Millicell小室内加入2×104/200μl个细胞,小室内加入含10g/L BSA和1% FBS DMEM的培养液;小室外加入400μl条件培养液,常规培养24h后,取出Millicell小室,甲醇固定15min,HE染色,计数移至微孔膜下层的细胞数,计算侵袭抑制率。裸鼠试验性肺转移实验:选择20只4周龄雌性BALB/C-nu裸鼠,分别经尾静脉注射ACC-M-WJ4细胞、ACC-M-HK细胞和ACC-M细胞及生理盐水。注射量为0.2ml,其中含细胞4×106/只,每组5只。6周后处死裸鼠,称量裸鼠体重、新鲜肺重量,并观察裸鼠肺表面转移结节数量。肺标本常规固定、石蜡包埋,制备4μm组织切片,HE染色,进行组织病理学检查。全部数据用平均数±标准差表示,采用SPSS10.0统计分析软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异有显著性,具有统计学意义。结果1、制备及鉴定抗人XT-I蛋白多克隆抗体确定XT-I的N端氨基酸序列(175-205)为抗原表位,构建了重组表达载体,表达融合蛋白GST-XT,并以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。间接ELISA法证实其效价高;Western blot结果显示:该抗体特异性良好。2、构建靶向抑制人XT-I基因的shRNA真核表达载体针对XT-I基因的mRNA序列设计构建了2个特异性shRNA真核表达载体,分别命名为:shRNA-WJ3和shRNA-WJ4;阴性对照质粒命名为:shRNA-HK。经酶切及核酸测序鉴定证实:shRNA-WJ3和shRNA-WJ4、shRNA-HK均符合设计要求。3、shRNA真核表达载体对XT-I基因沉默效果的测定并建立稳定阻抑PG合成的细胞株ACC-M细胞转染shRNA-WJ3和shRNA-WJ4后可稳定表达GFP,转染效率较高。经G418筛选获得稳定表达shRNA载体的细胞株,分别命名为:ACC-M-WJ3、ACC-M-WJ4和ACC-M-HK。Real-Time PCR和Western blot结果显示:shRNA-WJ3和shRNA-WJ4对XT-I的mRNA抑制率分别为83.70%、86.81%;对XT-I的蛋白表达抑制率分别为79.60%和80.10%。ACC-M-WJ3和ACC-M-WJ4细胞每24h分泌的PG(GAGs)抑制率为49.70%-66.06%。4、沉默XT-I基因阻抑PG的合成分泌对ACC-M细胞增殖的影响倒置显微镜下观察发现:转染后的ACC-M细胞出现明显细胞凋亡;ACC-M-WJ3细胞胞浆固缩,细胞膜皱缩,细胞核变小、染色质固缩、边集、消失。对照组细胞未见改变。细胞计数与MTT法检测细胞增殖发现:ACC-M-WJ3细胞的增殖受到抑制,增殖速度明显低于空白对照ACC-M细胞和阴性对照ACC-M-HK细胞。ACC-M-WJ3细胞克隆形成率为:18.93±5.43%,与ACC-M细胞(37.40±2.86%)和ACC-M-HK细胞(32.87±5.70%)相比,明显减少,差异有显著性(P<0.05);克隆形成抑制率为49.39%。流式细胞术检测各组细胞周期显示:ACC-M-WJ3细胞与ACC-M细胞和ACC-M-HK细胞相比:S期细胞数目减少;G1/G0期细胞数目增加(P<0.05)。三组细胞的G2/M%期细胞数无显著性差异(P>0.05)。ACC-M-WJ3细胞、ACC-M细胞和ACC-M-HK细胞的PI指数分别为:25.1、60.63、52.63,差异有显著性(P<0.01)。ACC-M-WJ3组细胞凋亡率为28.44±3.45%,分别与ACC-M细胞(3.21±1.50)%和ACC-M-HK细胞(7.34±1.50)%相比,差异有显著性(P<0.01)。裸鼠皮下移植瘤实验显示:ACC-M-WJ3细胞组移植瘤瘤体增长缓慢,瘤体体积为1.78±0.71cm3,显著小于ACC-M-HK细胞组(2.83±0.16)cm3和ACC-M细胞组(3.09±0.06)cm3 (P<0.01)。ACC-M-WJ3细胞组移植瘤瘤重为:2.12±0.70g,与ACC-M-HK细胞组(3.63±0.12)g和ACC-M细胞组(4.97±0.14)g相比,有显著性差异(P<0.01),ACC-M-WJ3细胞组移植瘤瘤重抑瘤率为42.39%。病理学检查发现:ACC-M-WJ3细胞移植瘤中多见细胞成片凋亡的区域:大片细胞轮廓仍然存在,胞核消失。有的细胞体积缩小,胞浆固缩,细胞膜皱缩,胞核染色质固缩、边集;有的凋亡细胞可见凋亡小体。ACC-M和ACC-M-HK组裸鼠皮下移植瘤中未见明显细胞凋亡。5、沉默XT-I基因阻抑PG合成对ACC-M细胞侵袭转移特性的影响基底膜粘附实验表明:ACC-M-WJ4细胞、ACC-M细胞、ACC-M-HK细胞的粘附率分别为13.43±1.91%、23.30±1.45%和22.43±2.78%,差异具有显著性(P<0.05);ACC-M-WJ4细胞粘附抑制率为42.36%。基底膜侵袭试验显示:ACC-M-WJ4组细胞穿过微孔膜到达下层的细胞数量为:41.50±8.35个,较ACC-M-HK(83.53±10.21)和ACC-M (90.50±15.28)细胞明显减少(P<0.01),侵袭抑制率为54.14 %。迁移实验中人工划痕后12h时,ACC-M-WJ4组细胞越过划痕边缘向空白处运动生长的细胞数为115.92±6.81个,较ACC-M-HK细胞(283.53±9.72)和ACC-M细胞(289.50±23.02)明显减少(P<0.01)。裸鼠实验性肺转移实验显示:ACC-M-WJ4组肺转移率是40%(2/5);显著少于ACC-M-HK组(100%)和ACC-M组(100%);P<0.05。ACC-M-WJ4组肺表面结节数为4.8±3.89个,ACC-M组为49.4±4.81个、ACC-M-HK组为41.6±8.09个;ACC-M-WJ4组明显少于两对照组;P<0.01。含转移灶肺湿重量分别为:ACC-M细胞组(0.897±0.21)g、ACC-M-HK细胞组(0.786±0.28)g、ACC-M-WJ4细胞组(0.226±0.83)g、N.S组(0.196±0.03)g。ACC-M-WJ4组分别与ACC-M组、ACC-M-HK组相比,肺湿重差异有显著性,P<0.01;与N.S组无显著性差异,P>0.05。6、ACC-M-HK细胞和ACC-M细胞生物学行为检测无差异结论1、本研究中制备的抗人XT-I蛋白多克隆抗体,效价高、特异性好,可用于检测人细胞中XT-I蛋白的检测。2、靶向XT-I基因的shRNA真核表达载体shRNA-WJ3和shRNA-WJ4特异性沉默效率高,XT-I的mRNA抑制率为83.70%、86.81%;XT-I的蛋白抑制率分别为79.60%和80.10%。3、高效抑制XT-I基因可以显著降低ACC-M细胞合成分泌PG的水平,ACC-M-WJ3和ACC-M-WJ4细胞每24h的PG抑制率为49.70%- 66.06%。4、阻抑PG合成分泌的ACC-M细胞增殖受到明显抑制,克隆形成抑制率为49.39%。细胞周期发生改变:S期细胞数目减少;G1/G0期细胞数目增加;细胞出现凋亡,凋亡率为28.44±3.45%。5、裸鼠皮下移植瘤实验显示:阻抑PG合成的ACC-M-WJ3细胞组皮下移植瘤增殖明显被抑制,瘤重抑瘤率为42.39%。6、阻抑PG合成与分泌后ACC-M细胞体外粘附、侵袭、转移能力显著降低:粘附抑制率为42.36%,侵袭抑制率为54.14 %。7、阻抑PG合成与分泌后ACC-M细胞肺转移能力明显降低,转移率仅为40%。综上所述:本课题采用RNAi技术,沉默ACC-M细胞中人XT-I基因,有效地抑制了细胞PG合成与分泌。阻抑PG合成与分泌后ACC-M细胞的增殖、侵袭、转移等生物学行为受到明显抑制。PG合成、分泌与SACC的生物学行为密切相关。